Основной белок миелина. Демиелинизирующие заболевания. Маркеры функционального состояния эпифиза
Проведено изучение концентрации основного белка миелина (ОБМ) и нейронспецифической енолазы (НСЕ) в сыворотке крови у 84 больных хроническим гепатитом (ХГ) (вирусной этиологии HBV, HCV – 38; алкогольной этиологии – 17; аутоиммунный гепатит – 11; гепатит смешанной этиологии - 18) и 77 циррозом печени (ЦП) (вирусной этиологии HBV, HCV, HBV+HCV – 27; первичный билиарный цирроз – 10, алкогольной этиологии – 18; смешанной этиологии - 22). Контрольная группа - 30 практически здоровых лиц (доноры). Концентрации ОБМ и НСЕ в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем 449-5830 DSL МВР и 420-10 Fujirebio НСЕ. По результатам проведенного исследования при алкогольных поражениях печени как на стадии ХГ, так и сформировавшегося ЦП наблюдалось значительное повышение концентрации ОБМ крови по сравнению с вирусными поражениями. Концентрация НСЕ у больных ЦП изучаемых этиологических групп, в отличие от ХГ, существенно не отличалась.
основной белок миелина
нейронспецифическая енолаза
хронический гепатит
цирроз печени
печеночная энцефалопатия.
1. Жукова И.А. Нейронспецифическая енолаза как неспецифический маркер нейродегенеративного процесса / И.А. Жукова, В.М. Алифирова, Н.Г. Жукова // Бюллетень сибирской медицины. – 2011. – Т. 10. - № 2. – С. 15-21.
2. Белопасов В.В. Клиническая дифференциация печеночной энцефалопатии у больных циррозом печени / В.В. Белопасов, Р.И. Мухамедзянова, М.К. Андреев, Б.Н. Левитан // Вятский медицинский вестник. - 2002. - № 1. - С. 46-47.
3. Ивашкин В.Т. Заболевания печени и печеночная энцефалопатия / В.Т. Ивашкин, Ф.И. Комаров, И.О. Иваников // Российский медицинский журнал. – 2001. - Т. 3. - № 12. - С. 150-155.
4. Левитан Б.Н. Хроническая патология печени и кишечный микробиоценоз (клинико-патогенетические аспекты) / Б.Н. Левитан, А.Р. Умерова, Н.Н. Ларина. – Астрахань: АГМА, 2010. - 135 с.
5. Левитан Б.Н. Изменения концентрации основного белка миелина в сыворотке крови при заболеваниях печени / Б.Н. Левитан, А.В. Астахин, О.О. Евлашева // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2015. - № 2. – С. 93.
6. Павлов Ч.С. Печеночная энцефалопатия: патогенез, клиника, диагностика, терапия / Ч.С. Павлов, И.В. Дамулин, В.Т. Ивашкин // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2016. - № 1. – С. 44-53.
7. Торопова Н.Е. Оценка информативности нейронспецифической енолазы, определяемой иммуноферментным методом / Н.Е. Торопова, Е.А. Дорофеева, С.П. Дворянинова, Ж.П. Васиева // Клиническая лабораторная диагностика. - 1995. – № 1. - С. 15–17.
8. Чехонин В.П. Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний / В.П. Чехонин, О.И. Гурина, Т.Б. Дмитриева и соавт. // Биомедицинская химия. – 2000. – Т. 46. - № 6. – С. 549–563.
9. Arguedas M.R. Influence of hepatic encephalopathy on healthy – related quality of life in patients with cirrhosis / M.G. Arguedas, T.G. Delawrence, B.M. Mcguire // Digestive diseases and sciences. – 2003. – V. 48. – P. 1622-1626.
10. Butterworth R.F. Pathophysiology of hepatic encephalopathy: The concept of synergism // Hepatol. Res. - 2008. - V. 38. - P. 116-121.
11. Isgro M. Neuron – specific enolase as a biomarker: biochemical and clinical aspects / M. Isgro, P. Bottoni, R. Scatena // AdvExp Mad Biol. – 2015. – Vol. 867. – P. 125-143.
12. Persson L. 100 protein and neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid and serum: markers of cell damage in human central nervous system / L. Persson, H.G. Hardemark, J. Gustaffson et al. // Stroke. - 1987. - Vol. 18. - P. 911-918.
13. Rabinowicz A. NSE as a useful prognostic factor for patients after cerebral hypoxia / A. Rabinowicz, H. Reiber // Epilepsia. - 1996. - Vol. 37. - P. 122-125.
14. Tzakos A. Structure and function of the myelin proteins: current status and perspectives in relation to multiple sclerosis / A. Tzakos, A. Troganis, V. Theodorou // Curr. Med. Chem. – 2005. – Vol. 12. – P. 1569-1587.
Хронический гепатит (ХГ) и цирроз печени (ЦП) являются полиэтиологическими заболеваниями. Общеизвестно, что инфицирование гепатотропными вирусами является основным этиологическим фактором, приводящим к развитию ХГ, а злоупотребление алкоголем, в свою очередь, является второй основной причиной данной патологии .
Течение и прогноз заболеваний печени в значительной мере определяется наличием и степенью выраженности поражения центральной нервной системы (ЦНС) . Печеночная энцефалопатия (ПЭ) представляет собой комплекс потенциально обратимых нервно-психических нарушений, обусловленных поражением ЦНС токсическими веществами, не обезвреженными патологически измененной печенью, возникающих прежде всего в результате острой или хронической печеночной недостаточности . Учитывая крайнюю агрессивность этих веществ, можно предположить, что под их воздействием происходит деструкция нервной ткани с высвобождением в жидкие среды организма продуктов ее распада .
Изучению диагностической и прогностической значимости таких маркеров нейродеструкции, как основной белок миелина (ОБМ) и нейронспецифическая енолаза (НСЕ), при различных патологических состояниях ЦНС посвящено достаточно большое количество исследований . В то же время вопрос об их диагностической ценности при хронических диффузных заболеваниях печени (ХДЗП) различной этиологии остается мало изученным. В связи с этим изучение ОБМ и НСЕ в зависимости от этиологии ХДЗП является актуальным и перспективным.
Цель: изучить диагностическую значимость определения концентрации основного белка миелина и нейронспецифической енолазы в сыворотке крови в зависимости от этиологии ХДЗП.
Материалы и методы. Для решения поставленных задач за период с 2012 по 2014 г. было обследовано 84 больных ХГ (вирусной этиологии HBV, HCV - 38; алкогольной этиологии - 17; аутоиммунный гепатит - 11; смешанной этиологии - 18) и 77 ЦП (вирусной этиологии HBV, HCV, HBV+HCV - 27; первичный билиарный цирроз - 10, алкогольной этиологии - 18; смешанной этиологии - 22), находившихся на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении ГБУЗ АО «АМОКБ». Среди обследованных больных с патологией печени была выделена группа из 17 пациентов, не вошедшая в состав больных ХГ. Эту группу составляли пациенты с острым алкогольным гепатитом (ОАГ), протекающим с симптомами выраженной печёночно-клеточной недостаточности. Контрольную группу составили 30 практических здоровых лиц (доноры).
Исследования проводились на основе собственных наблюдений и данных медицинской документации (клиническая история болезни, амбулаторная карта, заключения специалистов по параклиническим методам обследования).
Больные поступали в клинику в стадии обострения основного заболевания. При постановке диагноза использованы общепринятые в настоящее время классификации. Клинический диагноз устанавливался на основании жалоб больных, изучения анамнеза, физикальных данных, лабораторных и инструментальных методов исследования. В анамнезе уделялось особое внимание оперативным вмешательствам, гемотрансфузиям, употреблению алкоголя и внутривенных наркотических препаратов, длительному применению гепатотоксичных лекарственных препаратов, наличию наследственных заболеваний.
Критерии исключения: сопутствующая патология ЦНС, лечение препаратами, обладающими побочным нейротоксическим эффектом.
Концентрации ОБМ и НСЕ в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа при помощи наборов реагентов коммерческих тест-систем 449-5830 DSL МВР и 420-10 Fujirebio НСЕ.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для количественного сравнения признаков двух несвязанных групп применяли параметрический критерий Стьюдента (t). Корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции (r) проводили с использованием критерия Спирмена. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение. Концентрация ОБМ у больных ХГ вирусной этиологии в среднем составила 1,9±0,27 нг/мл, смешанной - 2,3±0,3 нг/мл, аутоиммунной 2,17±0,19 нг/мл, что достоверно не отличалось от результатов, полученных в группе доноров — 1,9±0,3 нг/мл (р>0,05) (рис. 1). Более значительное повышение уровня ОБМ было выявлено у больных хроническим гепатитом алкогольной этиологии, составив 2,9±0,39 нг/мл, что достоверно превышало значения, полученные в контрольной группе, а также у больных с вирусной этиологией заболевания (р<0,05). Максимальная концентрация ОБМ в сыворотке крови была выявлена в группе больных ОАГ, составив в среднем 5,4±0,17 нг/мл, что достоверно превышало показатели, характерные как для здоровых лиц, так и для больных хроническим гепатитом вирусной, смешанной, аутоиммунной и алкогольной этиологии (р<0,05). В исследуемой группе пациентов ОАГ максимальная концентрация ОБМ в периферической крови наблюдалась в 75% случаев.
Результаты, полученные при исследовании концентрации НСЕ у больных ХГ и ОАГ, несколько отличались (рис. 2).
Концентрация НСЕ у больных хроническим гепатитом вирусной этиологии составила 6,9±0,41 нг/мл, смешанной - 7,4±0,37 нг/мл, аутоиммунной - 6,4±0,52 нг/мл. Полученные результаты близки и достоверно не отличались от значений, полученных в контрольной группе - 6,49±0,41 нг/мл (р>0,05).
Уровень НСЕ у больных хроническим гепатитом алкогольной этиологии в среднем составил 8,1±0,51 нг/мл, что достоверно выше, чем в контрольной группе, а также у больных аутоиммунным и ХГ вирусной этиологии (р<0,05).
Наиболее значительное повышение концентрации НСЕ, так же как и ОБМ, было выявлено у больных ОАГ, составив в среднем 14,3±0,47 нг/мл, причём у 81% обследованных пациентов полученные результаты существенно превышали показатели, характерные для доноров, а также больных хроническим гепатитом вирусной, смешанной, аутоиммунной и алкогольной этиологии (р<0,05), достигая 25 нг/мл.
Рис. 1. Концентрация ОБМ у больных ХГ в зависимости от этиологии:
Рис. 2. Концентрация НСЕ у больных ХГ в зависимости от этиологии:
1 - вирусный гепатит (HBV, HCV); 2 - аутоиммунный гепатит; 3 - алкогольный гепатит;
4 - гепатит смешанной этиологии; 5 - контроль
Высокая концентрация в периферической крови изучаемых маркеров повреждения нервной ткани, таких как ОБМ и НСЕ, выявленная нами при алкогольных поражениях печени, вероятно, является проявлением демиелинизирующих процессов, нередко наблюдаемых при данной патологии. Выявленные закономерности говорят в пользу того, что причинами развития атрофических изменений головного мозга и повреждений нервных волокон (маркерами которых являются ОБМ и НСЕ), часто встречающихся у лиц, злоупотребляющих алкоголем, является не только нейротоксический эффект этанола и его метаболитов, но и такие факторы, как дисфункция печени, нарушения питания, а также дефицит витаминов группы В и никотиновой кислоты.
Как уже говорилось выше, основным этиологическим фактором, приводящим к возникновению хронических гепатитов, является гепатотропная вирусная инфекция.
Показатели концентрации ОБМ и НСЕ в сыворотке крови больных ХГ в зависимости от вида гепатотропного вируса (В и С) были близки и достоверно не отличались друг от друга, а также от показателей, полученных в контроле (р>0,05). Также не было выявлено существенных различий концентраций исследуемых маркеров деструкции нервной ткани у больных ХГС с 1 генотипом и генотипом «не-1» (2 и 3а). Следовательно, уровень в периферической крови изучаемых нами показателей не зависит от типа вирусов.
Обращает на себя внимание, что показатели концентрации ОБМ и НСЕ у больных ХГ вирусной и ХГ смешанной этиологии (вирусной+алкогольной) существенно не отличаются друг от друга, а также от результатов, полученных в контроле (р>0,05). В то же время установлено, что сочетание вирусного и алкогольного факторов оказывает более существенное влияние на состояние изучаемых маркеров нейродеструкции, чем только при вирусной этиологии. Так, если у больных смешанной этиологии уровень ОБМ в 42% случаев превышал показатели, характерные для здоровых лиц, то при хронических вирусных гепатитах лишь в 30%. Концентрация НСЕ соответственно в 39% случаев превышала показатели, характерные для здоровых лиц при смешанной этиологии заболевания, а при вирусной лишь в 31%. На наш взгляд, это косвенно свидетельствует о том, что высокая концентрация изучаемых маркеров повреждения нервной ткани, выявленный у части больных ХГ, более характерна при наличии такого этиологического фактора, как злоупотребление алкоголем.
Проведённый в общей группе больных ХГ корреляционный анализ значений ОБМ и НСЕ показал отсутствие достоверных связей между данными показателями. В то же время в группе больных с алкогольными поражениями печени была выявлена положительная слабой силы корреляционная связь между концентрациями ОБМ и НСЕ (r=0,45), что, на наш взгляд, косвенно свидетельствует о близких механизмах, приводящих к повышению уровня этих маркеров повреждения нервной ткани при данной патологии.
Выявленные закономерности позволяют использовать определение уровня ОБМ и НСЕ в сыворотке крови больных ХГ в качестве дополнительного маркера при диагностике различных этиологических форм хронического гепатита, прежде всего алкогольной этиологии, а также для выявления наличия демиелинизирующих процессов при данной патологии.
Учитывая, что имеются этиологические особенности характера течения ЦП, темпов прогрессирования, развития осложнений, было проведено изучение концентрации ОБМ и НСЕ в зависимости от этиологии заболевания. У 27 больных (35%) был диагностирован ЦП вирусной этиологии, у 18 (23%) - алкогольный, у 22 (29%) в анамнезе злоупотребление алкоголем и перенесенный вирусный гепатит одновременно (смешанная этиология), у 10 больных (13%) был диагностирован первичный билиарный цирроз печени. Концентрации ОБМ и НСЕ у больных ЦП вирусной этиологии составили 2,3±0,42 и 8,2±0,56 нг/мл, смешанной - 2,7±0,34 и 7,8±0,43 нг/мл, билиарной 3,2±0,39 и 8,3±0,39 нг/мл, алкогольной 3,4±0,3 и 8,9±044 нг/мл соответственно.
Средние значения концентрации НСЕ в группах больных ЦП вирусной, билиарной и алкогольной этиологии достоверно (р<0,05) превышали показатели в контрольной группе. В то же время отсутствовали достоверные различия концентраций НСЕ в периферической крови в зависимости от этиологии ЦП. Результаты проведённого исследования свидетельствуют, что на стадии ЦП, в отличие от ХГ, концентрация данного маркера нейродеструкции в периферической крови не связана с этиологией заболевания.
Следовательно, на стадии сформировавшегося ЦП причины, обусловливающие повышение уровня НСЕ в периферической крови, несколько отличаются от таковых при гепатитах (ОАГ, ХГ). Вероятно, ведущую роль играет нейротоксическое действие продуктов эндогенной интоксикации, циркулирующих в крови при тяжелой дисфункции печени, а не прямое действие этанола и его метаболитов.
Помимо того что НСЕ прежде всего относится к внутриклеточным энзимам центральной нервной системы и считается одним из наиболее специфичных показателей ее повреждения, в то же время существует пять молекулярных форм изоферментов НСЕ, обнаруживаемых не только в нейронах, но и в нейроэндокринных клетках, скелетной мускулатуре, печени, эритроцитах и тромбоцитах, и колебания ее общего уровня могут быть связаны напрямую с тяжелой дисфункцией печени и развитием различных осложнений, характерных для ЦП.
Результаты, полученные при исследовании уровня ОБМ в периферической крови больных ЦП различной этиологии, несколько отличались.
Так, результаты исследования свидетельствуют, что при ЦП билиарной (3,2±0,39 нг/мл) и алкогольной (3,4±0,3 нг/мл) этиологии значения ОБМ достоверно повышены по сравнению с контрольной группой - 1,9±0,3 нг/мл и больными циррозом печени вирусной этиологии - 2,3±0,42 нг/мл (р<0,05). При ЦП вирусной этиологии уровень ОБМ был наиболее низким, сопоставимым с показателями, полученными в контроле (р>0,05). При ЦП смешанной этиологии (2,7±0,34 нг/мл) его уровень был несколько выше, чем при вирусной, и соответственно больше, чем в контроле, но достоверных различий при сопоставлении полученных результатов не выявлено (р>0,05). Несмотря на достоверную разницу показателей ОБМ крови у больных ЦП алкогольной этиологии и ПБЦ по сравнению с контролем, достоверного различия в уровне исследуемого белка между этими изучаемыми группами больных мы не выявили (р>0,05). Средние значения концентрации ОБМ в периферической крови у больных циррозом печени смешанной и алкогольной этиологии незначительно отличались друг от друга: 2,7±0,34 и 3,4±0,3 нг/мл соответственно, достоверного различия выявлено не было (р>0,05). Полученные результаты представлены на рис. 3 и 4.
Рис. 3. Концентрация НСЕ у больных ЦП в зависимости от этиологии: 1 - ЦП вирусной этиологии (HBV, HCV); 2 - первичный билиарный цирроз; 3 - ЦП алкогольной этиологии; 4 - ЦП смешанной этиологии; 5 - контроль
Рис. 4. Концентрация ОБМ у больных ЦП в зависимости от этиологии: 1 - ЦП вирусной этиологии (HBV, HCV); 2 - первичный билиарный цирроз; 3 - ЦП алкогольной этиологии; 4 - ЦП смешанной этиологии; 5 - контроль
Таким образом, выявленные закономерности аналогичны результатам, полученным у больных ХГ, в группе которых максимальная концентрация ОБМ плазмы так же наблюдалась при алкогольной этиологии заболевания.
Заключение. При алкогольных поражениях печени, как на стадии ХГ, так и сформировавшегося ЦП, наблюдается значительное повышение концентрации ОБМ крови по сравнению с вирусными поражениями, что подтверждает наше предположение о том, что, помимо нейротоксического действия продуктов эндогенной интоксикации, циркулирующих в крови при тяжелых поражениях печени, существенную роль в процессах нейродеструкции и демиелинизации нервных волокон играет прямой повреждающий эффект этанола и его метаболитов.
Библиографическая ссылка
Астахин А.В., Евлашева О.О., Левитан Б.Н. ОСНОВНОЙ БЕЛОК МИЕЛИНА И НЕЙРОНСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЕНОЛАЗА СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 2.;URL: http://сайт/ru/article/view?id=26162 (дата обращения: 17.12.2019).
Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Анализ фрагментации основного белка миелина под действием протеасомы
А. В. Бачева1#, А. А. Белогуров2, Н. А. Пономаренко2, В. Д. Кнорре2, В. М. Говорун2,
М. В. Серебрякова3, А. Г. Габибов1,2
1 Химический факультет Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова, Москва
2 Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва
3 Протеомный центр РАМН, НИИ Физико-химической медицины Росздрава РФ # e-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Протеасома - это высокомолекулярный белковый комплекс, служащий для направленной деградации белков в эукариотических клетках. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости как первого, так и второго класса. Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации основного белка миелина (ОБМ), составляющего около 30 % всех белков миелиновой оболочки аксонов нейронов. Детали этого механизма остаются невыясненными. В представленной работе изучены особенности специфической деградации ОБМ протеасомой.
Нами было продемонстрировано, что основной белок миелина (не подвергавшийся убиквитинилированию) является хорошим субстратом как для 20S, так и для 26S протеасомы. Впервые были определены сайты протеолиза ОБМ протеасомой из мозга мышей линий Ва1Ь/С и SJL и показаны значительные различия в паттерне деградации данного нейроантигена, что может свидетельствовать о лучшей презентации фрагментов основного белка миелина на комплексах гистосовместимости в случае мышей, предрасположенных к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
ВВЕДЕНИЕ
Рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенера-тивное заболевание аутоиммунной природы - представляет собой острую медико-социальную проблему, поскольку, как правило, поражает лиц молодого и среднего возраста. Проблема лечения РС остается далекой от разрешения, на сегодняшний день существуют лекарственные препараты, способные в некоторой степени замедлить течение РС, но не излечивать от этой патологии. Деградация нервных волокон, происходящая при рассеянном склерозе, протекает вследствие разрушения миелиновой оболочки нейронов. Одной из биохимических характеристик, которая отличает миелин от других биологических мембран, является высокое соотношение липид/белок. Белки составляют от 25 до 30 % массы сухого вещества миелиновой оболочки. Около 30 % всех белков миелина составляют три изоформы т. н. основного белка миелина (ОБМ). ОБМ является одним из основных аутоантигенов при РС. Ранее нами и другими исследователями было показано, что в деградации ОБМ могут принимать участие каталитические антитела , а также некоторые проте-
азы . Известно, что в любой эукариотической клетке существует специализированная органелла для направленной деградации белков - протеасома, представляющая собой высокомолекулярный белковый комплекс. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости (МНС) как первого, так и второго класса . Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации ОБМ. Детали этого механизма остаются невыясненными. В представленной работе нами были изучены особенности специфической деградации ОБМ протеасомой.
Известно, что 20S протеасома (мультикаталический протеиназный комплекс) - это олигомерная высокомолекулярная (700 кДа) протеиназа, которая может быть выделена индивидуально. Данный комплекс также является каталитическим ядром 26S протеасомы, в составе которой присутствуют одна или две регуляторных 19S субъединицы. Было показано, что и 20S и 26S протеасомы способны деградировать ОБМ . Вопрос о сайт-специфичности
BpeWR. МИНУТЫ
Рис. 1. Зависимость степени гидролиза ОБМ протеасомой от времени. Обозначения: о - 20S протеасома, - 26S протеасома, выделенные из печени аутбредных мышей
деградации ОБМ протеасомой оставался открытым. Кроме того, известно, что при многих воспалительных патологических процессах протеазный комплекс (конститутивная протеасома) переходит в форму иммунопротеасомы, обладающей альтернативной специфичностью и каталитической эффективностью по отношению к процессингу внутриклеточных белков. Скорее всего, это «переключение» имеет непосредственное отношению к различной презентации антигенов в норме и патологии. Паттерн деградации ОБМ иммунопротеасомой до настоящего времени изучен не был.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Протеасома была выделена и очищена по методу, описанному в . Сначала была исследована деградация ОБМ (изоформа с молекулярной массой 18.5 кДа из мозга быка) полным 26S комплексом и каталитической 20S субъединицей, выделенными из печени аутбредных мышей. Как показано на рис. 1, инкубация ОБМ как с 20S, так и с 26S протеасомой приводила к постепенной деградации ОБМ. Уже через 45 мин 20S протеасома полностью гидролизовала основной белок миелина, в то время как 26S протеасо-ме на это требовалось 85 мин. Такое различие в скоростях можно отнести к разному количеству протеасомы: в случае 20S протеасомы соотношение фермент/субстрат составило 2.7/1 (по белку, мкг/мкг) или 1/14.5 (моль/моль), а в случае 26S соотношение фермент/субстрат составило 1/1 (по белку, мкг/мкг) или 1/110 (моль/моль). Количество протеасомы оценивали по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
Гидролизаты ОБМ, полученные под действием 20S и 26S комплексов из печени аутбредных мышей, были разделены на фракции методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С4 (Waters, DeltaPak, 300 А). Наблюдаются некоторые отличия в профилях элюции, в частности, в некоторых пиках, совпадающих для 20S и 26S протеасом, содержится разное количество вещества, кроме того, при гидролизе 26S протеасомой появляются новые фракции. Таким образом,
паттерн деградации ОБМ 26S протеасомой несколько изменен по сравнению с таковым для 20S протеасомы. Отмеченные различия можно объяснить разной доступностью для протеолиза участков ОБМ, находящихся на поверхности белковой глобулы и в глубине молекулы, а также имеющих выраженную вторичную структуру. Для 26S протеасомы доступность разных участков ОБМ не имеет большого значения, поскольку в составе 19S субчастицы есть субъединицы, отвечающие за денатурацию молекул белка, которые будут подвергнуты деградации.
Пул протеасом неоднороден и состоит из макромоле-кулярных комплексов нескольких типов, причем каталитические субъединицы могут относиться к т. н. конститутивным (ßl, ß2 и ß5) или иммунным (ßli, ß2i и ß5i) (рис. 2). Шесть каталитических субъединиц протеасомы обладают тремя типами активности, а именно: химотрипсино-подобной (гидролиз после гидрофобных и ароматических аминокислот Leu, Tyr, Phe), трипсиноподобной (гидролиз после положительно заряженных Lys и Arg) и каспазо-подобной (гидролиз после отрицательно заряженных Asp и Glu) .
Соотношение конститутивная протеасома/иммунопро-теасома имеет ярко выраженную тканеспецифичность и в значительной степени зависит от иммунного статуса организма. Так, например, в головном мозге в норме более 90 % протеасом - конститутивные, а в селезенке около 9095 % протеасом являются иммунопротеасомами. Кроме того, в любых тканях под действием гамма-интерферона интенсивно нарабатываются иммуносубъединицы, которые встраиваются во вновь собранные мультикаталити-ческие комплексы . Ранее было показано, что замены каталитических субъединиц на иммунные приводят к изменению специфичности гидролиза и увеличению его скорости. Иммунопротеасома практически теряет способность
sm ■ . з1 »I Ri- Конститутивная ^ ■Шф Иммуно "шШЖМ TSf"fA qgjMSb-"" Рис. 2. Равновесие протеасома - иммунопротеасома. Иммунные каталитические субъединицы нарабатываются под действием гамма-интерферона Рис. 3. Аминокислотная последовательность ОБМ. Стрелками указаны протео-литические пептиды, определенные с помощью хромато-масс-спектрометрии в гидролизатах ОБМ протеасомой из мозга мышей линии SJL/J (верхняя часть рисунка) и Ва1Ь/С (нижняя часть рисунка). Толщина стрелок обозначает частоту встречаемости соответствующего пептида. Цветными прямоугольниками выделены иммунодоминантные районы ОБМ Рис. 4. Распределение по длинам пептидов, обнаруженных в гидролизатах ОБМ пулами протеасом из мозга мышей линии б) SJL/J. Столбиками на диаграмме представлены экспериментальные значения ионного тока для пептидов данной длины, полученные методом LC-MS масс-спектрометрии гидролизовать пептидные связи после остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот (каспазоподобная активность), зато значительно чаще происходит гидролиз после гидрофобных и особенно разветвленных гидрофобных аминокислотных остатков. Таким образом, под действием иммунопротеасомы получается большее количество пептидов, несущих гидрофобные аминокислоты на С-конце. Поскольку С-концевые гидрофобные аминокислоты являются важными якорными фрагментами для связывания с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости, следовательно, изменение в специфичности гидролиза приводит к увеличению выработки пептидов, образующих комплексы с молекулами MHC. Фрагменты, связанные с молекулами МНС, презентируются на внешней мембране клеткам иммунной системы. Таким образом, клетки, содержащие иммунопротеасому, будут более эффективно презентировать свои антигены. Кроме того, известно, что альфа-субъединицы каталитической 20S субчастицы протеасомы действуют как ворота, формируя аксиальный канал, регулирующий вход и выход белков и продуктов их деградации. Закрытие канала может, таким образом, способствовать более полной деградации субстратов, поскольку препятствует выходу частично гидролизованных полипептидов . Было также продемонстрировано , что открывание канала сильно влияет на кинетику протеолиза и распределение по длине гидролитических фрагментов, полученных in vitro. Если канал открыт, то скорость гидролиза увеличивается, но при этом средняя длина получающихся фрагментов также увеличивается на 40 %. Таким образом, более высокая скорость работы иммунопротеасомы должна приводить к более длинным пептидам - продуктам деградации, которые будут лучше связываться с молекулами МНС и, следовательно, более эффективно представляться на поверхности клетки. Известно, что мыши линии SJL генетически предрасположены к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Данная патология является животной моделью рассеянного склероза. С помощью иммуноблоттинга мы изучили состав пула протеасом в головном мозге мышей этой линии и показали, что содержание иммунопротеасом повышено по сравнению с мышами линии Balb/C (данные не приведены). Поэтому на следующем этапе из мозга мышей линии Balb/C и линии SJL была выделена 26S протеасома и изучен протеолиз ОБМ этими образцами протеасом. Гидролизаты ОБМ, полученные под действием протеасом, выделенных из мозга мышей этих двух линий, были исследованы методом LC-MS (высокоэффективная жидкостная хроматография с детекцией методом масс-спектрометрии). На рис. 3 приведена последовательность основного белка миелина с указанием мажорных фрагментов, продуцируемых пулами протеасом из разных источников. Толщина соответствующих стрелок демонстрирует относительное количество пептида в гидролизате при анализе. В аминокислотной последовательности ОБМ выделяют следующие области, соответствующие иммунодоминант-ным районам белка: 12-31, 82-98, 110-128 и 144-169, причем фрагмент 85-98 представляет собой т.н. энцефалитогенный эпитоп. Необходимо отметить, что деградация ОБМ протеасо-мой из печени аутбредных мышей, как полным комплексом, так и каталитической частью, не приводила к выщеплению иммуногенных пептидов, все они подвергались дальнейшей фрагментации внутри каталитической камеры протеасомы. В гидролизате ОБМ протеасомой из мозга мышей обеих линий практически единственным сайтом гидролиза, где протеасома проявляла свою каспазоподобную активность, была связь между аминокислотными остатками Asp81-Glu82, близкая к началу энцефалитогенного пептида. Характер гидролиза ОБМ протеасомами, выделенными из головного мозга мышей линии SJL и Balb/C, был различен. У мышей аутоиммунной линии генерируемые эпитопы существенно лучше колокализуются с иммунодоминантны-ми фрагментами белка. При действии данного пула на ОБМ содержание фрагмента энцефалитогенного пептида составляет до четверти всех получаемых фрагментов гидролиза. У мышей стандартной линии Balb/C - в два раза меньше. Кроме того, полученные фрагменты существенно хуже соотносятся с областями узнавания комплексов гистосовместимости второго класса. На рис. 4 представлено распределение по длинам пептидов в соответствующих гидролизатах. По оси ординат представлены экспериментальные значения ионного тока для пептидов данной длины, полученные методом LC-MS. Из рисунка видно, что максимум распределения приходится на пептиды длиной 8 аминокислот в случае протеасом из головного мозга мышей как линии SJL, так и Balb/C. Однако относительное значение среднего ионного тока в мак- симуме сильно различается, что свидетельствует о существенно большем количестве фрагментов данной длины в случае мышей аутоиммунной линии. В гидролизатах превалируют пептиды с четным числом аминокислотных остатков, ни в одном из них не было обнаружено пептидов короче четырех аминокислотных остатков. Эти данные согласуются с описанными в литературе , а также с тем, что одной из главных ролей протеасомы в клетке является генерация пептидов для последующей презентации на молекулах МНС I класса, на которые могут загружаться пептиды длиной до 10 аминокислотных остатков. Присутствующие в гидролизатах более длинные пептиды могут затем расщепляться до фрагментов меньшей длины и представляться на молекулах МНС I класса, а также участвовать в презентации на молекулах МНС II класса . Таким образом, в настоящей работе показано, что 20S и 26S протеасомы способны гидролизовать основной белок миелина, при этом молярное соотношение протеасома/ОБМ составило 1 /14.5 для 20S и 1/110 для 26S, время полного гидролиза 45 мин и 85 мин соответственно. После разделения гидролизатов методом LC-MS массы фрагментов были определены методом MALDI-масс-спектрометрии, и, после анализа аминокислотной последовательности ОБМ, идентифицированы сайты протеолиза. Нами было продемонстрировано, что основной белок миелина (не подвергавшийся убиквитинилированию) является хорошим субстратом как для 20S, так и для 26S протеасомы. Впервые были определены сайты протеоли-за ОБМ протеасомой из мозга мышей линий Balb/C и SJL и показаны значительные различия в паттерне деградации данного нейроантигена, что может свидетельствовать о лучшей презентации фрагментов основного белка миелина на комплексах гистосовместимости в случае мышей, предрасположенных к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Работа была поддержана грантами РФФИ 07-04-12100-офи, 09-04-01546-а, 07-04-92168-НЦНИ_а, NATO SFPP 982833 и программой президиума РАН фундаментальные науки - медицине 2008 г. Список литературы 1. Ponomarenko, N.A., Durova, O.M., Vorobiev, I.I., Aleksandrova, E.A., Telegin, G.B., Chamborant, O.A., Sidorik, L.L., Suchkov, S.V., Alekberova, Z.S., Gnuchev, N.V., Gabibov, A.G. // J. Immunol. Methods, 2002. V. 269, P. 197- 211. 2. Ponomarenko, N. A., Durova, O. M., Vorobiev, I. I., Belogurov, A. A., Telegin, G. B., Suchkov, S. V., Kiselev, S. L., Lagarkova, M. A., Govorun, V. M., Serebryakova, M. V., Gabibov, A.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. V. 103, P. 281-286. 3. Belogurov, A.A. Jr., Kurkova, I.N., Friboulet, A., Thomas, D., Misikov, V.K., Zakharova, M.Y., Suchkov, S.V., Kotov, S.V., Alehin, A.I., Avalle, B., Souslova, E.A., Morse, H.C. 3rd., Gabibov, A.G., Ponomarenko, N.A. // J. Immunol., 2008. V. 180, P. 1258-1267. 4. Polosukhina, D. I., Kanyshkova, T. G., Doronin, B. M., Tyshkevich, O. B., Buneva, V. N.. Boiko, A. N., Gusev E. I., Nevinsky, G. A., Favorova, O. O. // Immunol Lett., 2006. V. 103, P. 75-81. 5. Белогуров, А. А., Куркова, И. Н., Мисиков, В. К., Сучков, С. В., Телегин, Г. Б., Алехин, А. И., Гончаров, Н. Г., Кнорре, В. Д., Габибов, А. Г., Пономаренко, Н. А. // Доклады Академии Наук, 2007. Т. 413, С. 408-411. 6. Pritzker, L. B., Joshi, S., Gowan, J. J., Harauz, G., Moscarello, M. A., // Biochemistry, 2000. V. 39, P. 5374-5381. 7. Schaecher, K. E., Shields, D. C., Banik. N. L. // Neurochemical Research, 2001. V. 26, P 731-737. 8. Medveczky, P., Antal, J., Patthy, A., Kekesi, K., Juhasz, G., Szilagyi, L., Graf, L. // FEBS Lett, 2006. V. 580, P 545-552. 9. D"Souza, C. A., Moscarello, M. A. // Neurochem Res, 2006. V. 31, P 1045-1054. 10. Tewari, M. K., Sinnthamby, G., Rajagopal, D., Eiseinlohr L. C., // Nature Imm, 2005. V. 6, N. 3, P 287-294. 11. Lucas, J., Lobo, D., Terry, E., Hogan, E. L., Banik N. L. // Neurochem. Res., 1992. V. 17, 12. Akaishi, T., Shiomi, T., Sawada, H., Yokosawa, H. // Brain Research, 1996. V. 722, P 139-144 13. Абрамова, Е. Б., Астахова, Т. М., Ерохов, П. А., Шарова, Н. П. // Известия РАН, серия биологическая, 2004. Т. 2, С. 150-156. 14. Orlowski, M., Cardozo, C., Michaud, C. // Biochemistry, 1993. V. 32, P 1563-1572. 15. Namiki, S., Nakamura, T., Oshima, S., Yamazaki, M., Sekine, Y., Tsuchiya, K., Okamoto, R., Kanai, T., Watanabe, M. // FEBS Lett, 2005. V. 579, P. 2781-2787. 16. Kisselev, A. F., Kaganovich, D., Goldberg, A. L. // J. Biol. Chem., 2002. V. 277, P. 22260-22270. 17. Kohler, A., Cascio, P., Leggett, D. S., Woo, K. M., Goldberg, A. L., Finley, D. // Mol. Cell., 2001. V. 7, P. 1143-1152. 18. Mishto, M., Luciani, F., Holzhutter, H.G., Bellavista, E., Santoro, A., Textoris-Taube, K., Franceschi, C., Kloetzel, PM., Zaikin, A. // J. Biol. Chem., 2008. V. 377, P. 1607-1617. ,
Основно́й бело́к миели́на
(также осно́вный белок миелина
, англ. myelin basic protein
) - представляет собой основной (порядка 50 %) белковый компонент миелина . При электрофоретическом анализе в ПААГ с SDS экстрактов миелиновой оболочки человека определяется до 10 полос. Основной белок миелина находится в комплексе с липидами и имеет молекулярную массу около 30 кДа.
Для основного белка миелина человека существует полиморфизм последовательностей аминокислот в 46 и 47 положении. В данном положении находятся остатки глицина, часто в сочетании остатками серина. Было показано, что у больных с рассеянным склерозом отмечалась замена серина на глицин в 44-49 положениях. Рядом авторов была показана высокая степень гомологии - порядка 80-90 % аминокислотной последовательности основного белка миелина у различных видов животных. Так, аминокислотные последовательности основного белка миелина человека и быка отличаются лишь по остаткам аминокислот в нескольких положениях, в то время как основной белок миелина крысы отличается от основного белка миелина человека и быка положением 40 аминокислотных остатков в середине полипептидной цепи (от 118 до 157 остатка). Основной белок миелина содержит значительный процент (приблизительно 25 %) основных аминокислот (аргинин , лизин и гистидин), равномерно распределенных по всей полипептидной цепи, что обусловливает очень высокую изоэлектрическую точку (рI = 12-13). Такие особенности приводят к взаимодействию всей молекулы основного белка миелина с карбоксильными группами мембранных липидов. Основной белок миелина является мембранным белком и имеет значительное сродство к липидам, в комплексе с которыми и выделяется. Основной белок миелина является поликатионом и формирует особенно стабильные комплексы с анионными липидами. Несмотря на то, что степень связывания основного белка миелина значительно выше с кислыми липидами, она достаточно выражена и в отношении цвиттер-ионов, особенно в отношении сфингомиелина . Основной белок миелина также взаимодействует с фосфатидилэтаноламином при рН 7,2, когда этот липид находится преимущественно в цвиттер-форме. Необычна способность основного белка миелина образовывать нерастворимые комплексы с додецилсульфатом натрия при значениях рН выше и ниже изоэлектрической точки. При формировании комплексов основного белка миелина с основной массой анионных фосфолипидов , в равной степени играют роль как гидрофобные , так и электростатические взаимодействия . Наиболее выраженное влияние на стабилизацию липидов основной белок миелина показывает при встраивании в липидные хвосты. Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что при формировании миелина происходит погружение большей части молекул основного белка миелина в слой головок липидов. После введения основного белка миелина в ЦНС развиваются симптомы, схожие с симптомами рассеянного склероза . Появление этих симптомов получило название экспериментального аллергического энцефаломиелита . Нервная система выполняет важнейшие функции в организме. Она отвечает за все действия и мысли человека, формирует его личность. Но вся эта сложная работы была бы невозможна без одной составляющей — миелина. Миелин – это вещество, образующее миелиновую (мякотную) оболочку, которая отвечает за электроизоляцию нервных волокон и скорость передачи электрического импульса. Главная клетка нервной системы – нейрон. Тело нейрона называется сома. Внутри нее находится ядро. Тело нейрона окружено короткими отростками, которые называются дендриты. Они отвечают за связь с другими нейронами. От сомы отходит один длинный отросток – аксон. Он несет импульс от нейрона к другим клеткам. Чаще всего на конце он соединяется с дендритами других нервных клеток. Всю поверхность аксона покрывает миелиновая оболочка, которая представляет собой отросток клетки Шванна, лишенный цитоплазмы. По сути, это несколько слоев клеточной мембраны, обернутые вокруг аксона. Шванновские клетки, обволакивающие аксон, разделяются перехватами Ранвье, в которых отсутствует миелин. Основными функциями миелиновой оболочки являются: Нервные клетки изолированы благодаря своей оболочке, но все же взаимосвязаны между собой. Участки, в которых клетки соприкасаются, называются синапсы. Это место, где встречаются аксон одной клетки и сома или дендрит другой. Электрический импульс может передаваться внутри одной клетки или от нейрона к нейрону. Это сложный электрохимический процесс, который основан на перемещении ионов через оболочку нервной клетки. Изменение напряжения из-за движения ионов калия и натрия называется «потенциал действия». Он распространяется медленно, но миелиновая оболочка, обволакивающая аксон, ускоряет это процесс, препятствуя оттоку и притоку ионов калия и натрия из тела аксона. Проходя через перехват Ранвье, импульс перескакивает с одного участка аксона на другой, что и позволяет ему двигаться быстрее. После того, как потенциал действия пересекает разрыв в миелине, импульс останавливается, и возвращается состояние покоя. Такой способ передачи энергии характерен для ЦНС. Что касается вегетативной нервной системы, в ней часто встречаются аксоны, покрытые малым количеством миелина или вообще не покрытые им. Скачки между шванновскими клетками не осуществляются, и импульс проходит гораздо медленнее. Миелиновый слой состоит из двух слоев липидов и трех слоев белка. Липидов в нем гораздо больше (70-75%): Белковые слои тоньше липидных. Содержание белка в миелине – 25-30%: Существуют простые и сложные белки нервной ткани. Липиды играют ключевую роль в строении мякотной оболочки. Они являются структурным материалом нервной ткани и защищают аксон от потери энергии и ионных потоков. Молекулы липидов обладают способностью восстанавливать ткани мозга после повреждений. Липиды миелина отвечают за адаптацию зрелой нервной системы. Они выступают в роли рецепторов гормонов и осуществляют коммуникацию между клетками. Немаловажное значение в строении миелинового слоя имеют молекулы белков. Они наряду с липидами выступают в роли строительного материала нервной ткани. Их главной задачей является транспортировка питательных веществ в аксон. Также они расшифровывают сигналы, поступающие в нервную клетку и ускоряют реакции в ней. Участие в обмене веществ – важная функция молекул белка миелиновой оболочки. Наиболее частыми причинами разрушения мякотной оболочки являются: Демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы: Демиелинизирующие заболевания периферической нервной системы: Это лишь часть заболеваний, возникающих из-за разрушения миелинового слоя. Симптомы в большинстве случаев схожи. Точный диагноз можно поставить лишь после проведения компьютерной или магнитно-резонансной томографии. Немаловажную роль в постановке диагноза играет уровень квалификации врача.
Заболевания, связанные с разрушением мякотной оболочки, очень сложно лечить. Терапия направлена в основном на купирование симптомов и остановку процессов разрушения. Чем раньше диагностировано заболевание, тем больше шансов остановить его течение. Благодаря своевременному лечению можно запустить процесс восстановления миелина. Однако, новая миелиновая оболочка не будет так же хорошо выполнять свои функции. Кроме того, болезнь может перейти в хроническую стадию, а симптомы сохранятся, лишь слегка сгладятся. Но даже незначительная ремиелинизация способна остановить ход болезни и частично вернуть утраченные функции. Современные лекарственные средства, направленные на регенерацию миелина более эффективны, но отличаются очень высокой стоимостью. Для лечения заболеваний, вызванных разрушением миелиновой оболочки, используются следующие препараты и процедуры: В настоящее время лечение демиелинизации не дает стопроцентного результата, но учеными активно ведутся разработки лекарственных средств, направленных на восстановление мякотной оболочки. Исследования проводятся по следующим направлениям: Возможно, в скором времени заболевания, связанные с разрушением миелина, перестанут быть неизлечимыми. Основной белок миелина (ОБМ) - один из главных белковых компонентов
миелина центральной нервной системы
, составляющий около 30% общего содержания протеинов в
миелине . ОБМ не является интегральным
мембранным белком. Различают его растворимую фракцию, присутствующую в
цитоплазме олигодендроцитов
перед включением в мембраны миелина, и нерастворимую, входящую в состав
миелина. В миелине ОБМ локализован с цитоплазматической стороны
элементарной мембраны [
Davies L., Sonston G. 1974
]. ОБМ играет важную роль в организации, сборке и поддержании структурной
целостности миелина. Выделены участки белка, стимулирующие рост астроглии
(полипептидная цепочка 44-59), усиливающие синтез элементов
соединительной ткани (полипептидная цепочка 44-166) [
Shefflld W., Kim S. 1977
]. Установлено, что ОБМ инактивирует ряд ингибиторов сериновых протеиназ -
антитрипсина
и микроглобулина
, обладает лектиноподобной активностью, специфической к галактозным и
галактозаминовым остаткам [
Lisak R.P., Zweiman D. 1977
]. Парентеральное введение ОБМ вызывает развитие аллергического лейкоэнцефалита
, сопровождающегося диффузной демиелинизацией [
Жаботинский Ю.М. 1975
]. Было установлено, что разные пептидные фрагменты молекулы ОБМ могут
проявлять энцефалитогенные свойства. Наиболее вероятным носителем
энцефалитогенной детерминанты всего белка является нонапептид с
последовательностью аминокислот 114-122 (-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg-)
[
Хохлов А.П., Баскаева Т.С. 1986
]. Генная мутация, ведущая к недостаточному синтезу ОБМ у экспериментальных
животных, приводит к развитию демиелинизирующего процесса в мозге и
появлению гиперкинезов
(модель "трясущихся" мышей) [
Ulrich J. 1993
]. Введение белка на ранних стадиях эмбриогенеза в зародыш трансгенных
животных предотвращает развитие характерной неврологической симптоматики и
раннюю смертность [
Ulrich J. 1993
]. Все открытые свойства ОБМ позволяют связать нарушения его метаболизма с
развитием демиелинизирующего процесса. В связи с этим определение ОБМ и
антител к нему проводили в основном у больных с
рассеянным склерозом
и другими демиелинизирующими заболеваниями
. Деструкция белого вещества мозга сопровождается выходом ОБМ из
пораженной ткани и накоплением его в цереброспинальной жидкости, в связи с
чем уровень белка может являться чувствительным индикатором выраженности
патологического процесса. Проникая через гематоэнцефалический барьер, ОБМ и
его фрагменты стимулируют синтез антител к компонентам миелина, что
поддерживает течение заболевания. Исследования ОБМ при сосудистой патологии головного мозга фрагментарны.
Экспериментально показано, что априорная сенсибилизация к ОБМ значительно
ухудшает прогноз инсульта
и увеличивает размеры инфаркта мозга
. В клиническом исследовании J. Palfreyman с соавт. [
Palfreyman J. 1979
] выявлено увеличение концентрации ОБМ в сыворотке крови больных с острыми
нарушениями мозгового кровообращения, сохранявшееся на протяжении первых 7
дней заболевания. Отмечена корреляция между уровнем ОБМ в сыворотке крови и
прогнозом инсульта.Строение
Напишите отзыв о статье "Основной белок миелина"
Примечания
См. также
Литература
Отрывок, характеризующий Основной белок миелина
Ничего больше не думая, и ничего не решая, я просто «улетела» туда, куда стремилась моя израненная Душа, чтобы спастись... Чтобы хотя бы чуточку отдохнуть и забыться, уйдя далеко от злого «земного» мира туда, где царил только свет...
Я знала, что Караффа не оставит меня надолго в покое, несмотря на то, что мне только что пришлось пережить, даже наоборот – он будет считать, что боль ослабила и обезоружила меня, и возможно именно в этот момент попробует заставить меня сдаться, нанеся какой-то очередной ужасающий удар...
Дни шли. Но, к моему величайшему удивлению, Караффа не появлялся... Это было огромным облегчением, но расслабляться, к сожалению, не позволяло. Ибо каждое мгновение я ожидала, какую новую подлость придумает для меня его тёмная, злая душа...
Боль с каждым днём потихонечку притуплялась, в основном, благодаря пару недель назад происшедшему и совершенно меня ошеломившему неожиданному и радостному происшествию – у меня появилась возможность слышать своего погибшего отца!..
Я не смогла увидеть его, но очень чётко слышала и понимала каждое слово, будто отец находился рядом со мной. Сперва я этому не поверила, думая, что просто брежу от полного измождения. Но зов повторился... Это и, правда, был отец.
От радости я никак не могла придти в себя и всё боялась, что вдруг, прямо сейчас, он просто возьмёт и исчезнет!.. Но отец не исчезал. И понемножку успокоившись, я наконец-то смогла ему отвечать...
– Неужели это и правда – ты!? Где же ты сейчас?.. Почему я не могу увидеть тебя?
– Доченька моя... Ты не видишь, потому, что совершенно измучена, милая. Вот Анна видит, я был у неё. И ты увидишь, родная. Только тебе нужно время, чтобы успокоиться.
Чистое, знакомое тепло разливалось по всему телу, окутывая меня радостью и светом...
– Как ты, отец!?. Скажи мне, как она выглядит, эта другая жизнь?.. Какая она?
– Она чудесна, милая!.. Только пока ещё непривычна. И так не похожа на нашу бывшую, земную!.. Здесь люди живут в своих мирах. И они так красивы, эти «миры»!.. Только у меня не получается ещё. Видимо, пока ещё рано мне... – голос на секунду умолк, как бы решая, говорить ли дальше.
– Меня встретил твой Джироламо, доченька... Он такой же живой и любящий, каким был на Земле... Он очень сильно скучает по тебе и тоскует. И просил передать тебе, что так же сильно любит тебя и там... И ждёт тебя, когда бы ты ни пришла... И твоя мама – она тоже с нами. Мы все любим и ждём тебя, родная. Нам очень не хватает тебя... Береги себя, доченька. Не давай Караффе радости издеваться над тобою.
– Ты ещё придёшь ко мне, отец? Я ещё услышу тебя? – боясь, что он вдруг исчезнет, молила я.
– Успокойся, доченька. Теперь это мой мир. И власть Караффы не простирается на него. Я никогда не оставлю ни тебя, ни Анну. Я буду приходить к вам, когда только позовёшь. Успокойся, родная.
– Что ты чувствуешь, отец? Чувствуешь ли ты что-либо?.. – чуть стесняясь своего наивного вопроса, всё же спросила я.
– Я чувствую всё то же, что чувствовал на Земле, только намного ярче. Представь рисунок карандашом, который вдруг заполняется красками – все мои чувства, все мысли намного сильнее и красочнее. И ещё... Чувство свободы потрясающе!.. Вроде бы я такой же, каким был всегда, но в то же время совершенно другой... Не знаю, как бы точнее объяснить тебе, милая... Будто я могу сразу объять весь мир, или просто улететь далеко, далеко, к звёздам... Всё кажется возможным, будто я могу сделать всё, что только пожелаю! Это очень сложно рассказать, передать словами... Но поверь мне, доченька – это чудесно! И ещё... Я теперь помню все свои жизни! Помню всё, что когда-то было со мною... Всё это потрясает. Не так уж и плоха, как оказалось, эта «другая» жизнь... Поэтому, не бойся, доченька, если тебе придётся придти сюда – мы все будем ждать тебя.
– Скажи мне отец... Неужели таких людей, как Караффа, тоже ждёт там прекрасная жизнь?.. Но ведь, в таком случае, это опять страшная несправедливость!.. Неужели опять всё будет, как на Земле?!.. Неужели он никогда не получит возмездие?!!
– О нет, моя радость, Караффе здесь не найдётся места. Я слышал, такие, как он, уходят в ужасный мир, только я пока ещё там не был. Говорят – это то, что они заслужили!.. Я хотел посмотреть, но ещё не успел пока. Не волнуйся, доченька, он получит своё, попав сюда.
– Можешь ли ты помочь мне оттуда, отец?– с затаённой надеждой спросила я.
– Не знаю, родная... Я пока ещё не понял этот мир. Я как дитя, делающее первые шаги... Мне предстоит сперва «научиться ходить», прежде чем я смогу ответить тебе... А теперь я уже должен идти. Прости, милая. Сперва я должен научиться жить среди наших двух миров. А потом я буду приходить к тебе чаще. Мужайся, Изидора, и ни за что не сдавайся Караффе. Он обязательно получит, что заслужил, ты уж поверь мне.
Голос отца становился всё тише, пока совсем истончился и исчез... Моя душа успокоилась. Это и правда был ОН!.. И он снова жил, только теперь уже в своём, ещё незнакомом мне, посмертном мире... Но он всё также думал и чувствовал, как он сам только что говорил – даже намного ярче, чем когда он жил на Земле. Я могла больше не бояться, что никогда не узнаю о нём... Что он ушёл от меня навсегда.
Но моя женская душа, несмотря ни на что, всё так же скорбела о нём... О том, что я не могла просто по-человечески его обнять, когда мне становилось одиноко... Что не могла спрятать свою тоску и страх на его широкой груди, желая покоя... Что его сильная, ласковая ладонь не могла больше погладить мою уставшую голову, этим как бы говоря, что всё уладится и всё обязательно будет хорошо... Мне безумно не хватало этих маленьких и вроде бы незначительных, но таких дорогих, чисто «человеческих» радостей, и душа голодала по ним, не в состоянии найти успокоения. Да, я была воином... Но ещё я была и женщиной. Его единственной дочерью, которая раньше всегда знала, что случись даже самое страшное – отец всегда будет рядом, всегда будет со мной... И я болезненно по всему этому тосковала...
Кое-как стряхнув нахлынувшую печаль, я заставила себя думать о Караффе. Подобные мысли тут же отрезвляли и заставляли внутренне собираться, так как я прекрасно понимала, что данный «покой» являлся всего лишь временной передышкой...
Но к моему величайшему удивлению – Караффа всё также не появлялся...
Проходили дни – тревога росла. Я пыталась придумать какие-то объяснения его отсутствию, но ничего серьёзного, к сожалению, в голову не приходило... Я чувствовала, что он что-то готовит, но никак не могла угадать – что. Измученные нервы сдавали. И чтобы окончательно не сойти с ума от ожидания, я начала каждодневно гулять по дворцу. Выходить мне не запрещалось, но и не одобрялось, поэтому, не желая далее сидеть взаперти, я для себя решила, что буду гулять... несмотря на то, что возможно это кому-то и не понравится. Дворец оказался огромным и необычайно богатым. Красота комнат поражала воображение, но лично я в такой бьющей в глаза роскоши никогда не смогла бы жить... Позолота стен и потолков давила, ущемляя мастерство изумительных фресок, задыхавшихся в сверкающем окружении золотых тонов. Я с наслаждением отдавала дань таланту художников, расписывавших это чудо-жилище, часами любуясь их творениями и искренне восхищаясь тончайшим мастерством. Пока что никто меня не беспокоил, никто ни разу не остановил. Хотя постоянно встречались какие-то люди, которые, встретив, с уважением кланялись и уходили дальше, спеша каждый по своим делам. Несмотря на такую ложную «свободу», всё это настораживало, и каждый новый день приносил всё большую и большую тревогу. Это «спокойствие» не могло продолжаться вечно. И я была почти уверена, что оно обязательно «разродится» какой-то жуткой и болезненной для меня бедой...
Анатомия миелина в строении нерва
Функции
Как работают импульсы
В спокойном состоянии внутрь нейрона попадают только ионы калия, а ионы натрия остаются снаружи. В момент возбуждения они начинаются меняться местами. Аксон положительно заряжается изнутри. Затем натрий перестает поступать через мембрану, а отток калия не прекращается.Состав
Роль липидов в строении оболочки
Роль белков
Дефекты миелинизации
Разрушение миелинового слоя нервной системы – очень серьезная патология, из-за которой происходит нарушение передачи нервного импульса. Она вызывает опасные заболевания, зачастую несовместимые с жизнью. Существуют два типа факторов, влияющие на возникновение демиелинизации:Почему происходит разрушение
Заболевания вследствие демиелинизации
Принципы лечения дефектов оболочки
Возможности восстановления миелина
Терапия
Прогноз по заболеваниям