Жизнь хреновая. Способ получения пероксидазы хрена Конформационные различия нативной и рекомбинантной форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами
Пероксидаза - один из наиболее распространенных ферментов, содержащийся в растениях, микробах, тканях животных. Этот фермент катализирует окисление широкого спектра органических соединений пероксидом водорода с образованием токсичных пероксидов, удаляющихся из живых организмов . Пероксидаза представляет собой гликопротеид, состоящий из полипептидной цепи, формирующей двухдоменную глобулу, и гемовой простетической группы с атомом железа, располагающейся между доменами .
Основной отличительной особенностью в структуре пероксидазы С хрена по сравнению с другими растительными пероксидазами является наличие участка длиной в 34 аминокислотных остатка между спиралями остатков фенилаланина (F) и глицина G (рис. 1). Эта область, которая является частью канала для доступа субстрата, не встречается у пероксидаз других классов, более того она имеет отличия даже в пределах своего класса. Для пероксидазы С хрена, характеризующейся большей F-G-вставкой (на 7 аминокислотных остатков), идентифицирован ключевой остаток, способный вступать в прямые взаимодействия с ароматическими донорными молекулами. Изофермент С пероксидазы хрена уникален тем, что имеет кольцо из трех периферийных остатков Phe142, Phe68 и Phe179, которое защищает подход к подвергающемуся воздействию краю гема. Эта ароматическая область важна для реализации способности пероксидазы связывать ароматические субстраты.
Рис. 1. Пространственная структура пероксидазы C хрена .
Особенностью процессов пероксидазного катализа является образование ряда спектрофотометрически различимых комплексов. Упрощенная схема пероксидазного цикла выглядит следующим образом:
Е + H 2 O 2 → E 1 ; k 1
E 1 + АH 2 → E 2 + АH; k 2
E 2 + АH 2 → Е + АH; k 3
где Е, Е 1 , Е 2 - соответственно исходная пероксидаза и ее окисленные формы; АН 2 , АН - соответственно исходный субстрат и его окисленная форма.
Продукт первой стадии - E 1 , образующийся при действии пероксида водорода на фермент, представляет собой окисленное производное пероксидазы, содержащее два окислительных эквивалента. В Е 1 железо имеет формальный заряд +4. Дополнительный окислительный эквивалент в молекуле Е 1 локализуется либо на порфириновом макроцикле пероксидазы, либо на одной из функциональных групп фермента.
Донорные субстраты могут восстанавливать соединение E 1 непосредственно в нативный фермент (двухэлектронное восстановление) или через образование промежуточного соединения E 2 (одноэлектронное восстановление).
В реакции пероксидазного окисления, помимо пероксида водорода, в качестве окислителя (первого субстрата) могут выступать органические субстраты – алкилгидропероксиды, пероксибензольные кислоты и др. По отношению ко второму субстрату пероксидаза проявляет меньшую специфичность, поэтому целый ряд электронодонорных соединений могут использоваться в качестве субстратов пероксидазы и являться основой детектирующих систем в методах аналитической биохимии и клинической медицины.
- Специальность ВАК РФ03.00.23
- Количество страниц 106
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Глава 1. СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И НОВЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАТИВНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЕРОКСИДАЗ.
1.1. Введение.
1.2. Кристаллические структуры пероксидаз.
1.3. Кислотно-основной катализ пероксидаз.
1.4. Металл-связывающие сайты.
1.5. Архитектура активного центра ПХ.
1.5.1 Структура дистальной области ПХ и система водородных связей.
1.5.2. Структура проксимальной области ПХ и система водородных связей.
1.5.3. Сайт связывания ароматических субстратов.
1.6. Роль белкового окружения в пероксидазном катализе.
Глава 2. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗ.
2.1 Использование пероксидаз в)й1ушуноферментном анализе.
2.2. Биохимический анализ физиологически активных веществ.
2.3. Использование пероксидаз в биосенсорах.
2.4. Применение пероксидаз в биотрансформациях.
2.5. Использование пероксидаз для биоотбеливания в целлюлозно-бумажной промышленности.
Глава 3. ВЫДЕЛЕНИЕ, РЕНАТУРАЦИЯ И ОБРАЗОВАНИЕ
ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ, ЭКСПРЕССИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ E.coli В ТЕЛАХ ВКЛЮЧЕНИЯ.
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
4.1. Реагенты.
4.2. Методы исследования.
4.2.1 Клонирование рекомбинантных форм ПХ.
4.2.2 Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БПЖК.
4.2.3 Экспрессия рекомбинантной ПХ в клетках E.coli.
4.2.4 Протоколы рефолдинга и очистки рекомбинантной ПХ.
4.2.5 Физико-химические свойства рекомбинантных форм ПХ.
4.2.6 Адсорбционные и электрохимические измерения.
4.2.7 Расчет структурных изменений в мутантных формах пероксидазы хрена.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 5. ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
В КЛЕТКАХ E.coli: ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ, РЕФОЛДИНГА, РЕАКТИВАЦИИ И ОЧИСТКИ.
5.1. Экспрессия ПХ в периплазматическую область клеток E.coli BL21(DE3).
5.2. Оптимизация системы рефолдинга ПХ из тел включения при экспрессии в цитоплазматическую область клеток E.coli BL21(DE3)pLysS.
5.3. Свойства рекомбинантной ПХс 6xHis на С-конце.
5.4. Получение и свойства мутантных форм ПХ.
Глава 6. АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ПХ.
6.1 Амперометрическое определение Н2О2.
6.2 Стабильность сигнала биосенсора.
6.3 Разработка биферментных биосенсоров.
Глава 7. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО КОНЪЮГАТА
ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА С БПЖК.
7.1 Клонирование и экспрессия рекомбинантного конъюгата ПХ-БПЖК в клетках E.coli.
7.2 Физико-химические и иммунологические свойства рекомбинантного конъюгата ПХ-БПЖК.
V. ВЫВОДЫ.
Рекомендованный список диссертаций
Иммуноферментный анализ белка, связывающего жирные кислоты на основе рекомбинантных реагентов 2004 год, кандидат химических наук Андреева, Ирина Петровна
Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства 2007 год, кандидат химических наук Хушпульян, Дмитрий Михайлович
Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом 2007 год, кандидат химических наук Савватеева, Людмила Владимировна
Конформационные различия нативной и рекомбинантной форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами
Изучение организации фосфат-связывающей области бактериальных уридинфосфорилаз 2000 год, кандидат биологических наук Чеботаев, Дмитрий Владимирович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение, свойства и применение рекомбинантной пероксидазы хрена»
Изофермент С пероксидазы хрена (ЕС 1.11.1.7)- гликопротеин, молекулярная масса 44 кДа, относится к суперсемейству растительных пероксидаз , содержит простетическую группу протопорфирин-IX, два иона Са2+. ПХ катализирует одноэлектронное окисление большого числа органических и неорганических субстратов пероксидом водорода. ПХ нашла широкое применение в аналитической биохимии и биотехнологиии в качестве маркера антител, ДНК и низкомолекулярных соединений (аналитов).
В последние годы прогресс, достигнутый в клонировании и гетерологической экспрессии генов ПХ, открывает новые возможности по изучению структурно-функциональных взаимосвязей методами белковой инженерии.
Для получения рекомбинантной ПХ широкое распространение нашла система экспрессии в клетках E.coli. Существуют и другие способы экспрессии, такие как экспрессия в клетках насекомых , позволяющая получать фермент в активной, растворимой и гликозилированной форме, а также экспрессия в дрожжах . Однако, эти системы экспрессии достаточно дороги и трудоемки, кроме того, система экспрессии в клетках насекомых не поддается масштабированию, поэтому они и не нашли такого широкого распространения, как экспрессия в клетках E.coli.
Рекомбинантная ПХ экспрессируется в клетках E.coli в нерастворимой, неактивной форме в телах включения. Процесс рефолдинга и реактивации апо-пероксидазы простетической группой многостадийный и достаточно трудоемкий.
Для прикладного применения, такого как, например, использования в биосенсорах, необходим более эффективный и надежный способ получения рекомбинантной ПХ. Таким образом, одной из основных задач данной работы был поиск путей оптимизации ранее описанных протоколов рефолдинга, реактивации и очистки рекомбинантной ПХ, а также исследование возможности периплазматической экспрессии для получения растворимого, активного фермента.
Высокая каталитическая активность ПХ в реакции восстановления пероксида водорода позволяет использовать пероксидазу в качестве высокоэффективного биоэлектрокатализатора, участвующего в прямом переносе электрона между электродом, активным центром фермента и субстратом. В присутствии субстрата при некотором потенциале электрода наблюдается пропорциональность между измеряемым током восстановления и концентрацией Н2О2. При этом эффективность прямого (безмедиаторного переноса электрона) является одним из важнейших условий разработки амперометрических биосенсорных систем на основе ПХ. Из всего вышеизложенного органически вытекает следующая цель настоящей работы -модификация поверхности рекомбинантной ПХ методами сайт-направленного мутагенеза функциональными группами для обеспечения эффективной ориентированной иммобилизации молекулы ПХ на поверхности электродов. В работе была предложена стратегия введения коротких олигогистидиновых последовательностей в поверхностные участки ПХ, что с одной стороны должно было обеспечить эффективную очистку рекомбинантного фермента с использованием металл-хелатной хроматографии (Ni-NTA агароза), и в то же время способствовать эффективной адсорбции соответствующих мутантов на поверхности золотых электродов (известно, что гистидины необратимо сорбируются на золоте).
Пероксидаза хрена нашла широкое применение в качестве фермента-маркера для иммуноферментного анализа. Химическое коньюгирование белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации фермента и гетерогенности конъюгатов, что в свою очередь, оказывает влияние на специфичность и чувствительность анализа.
С развитием генной инженерии появилась возможность создавать рекомбинантные конъюгаты фермента маркера с антителами и белковыми антигенами. Такие конъюгаты обладают рядом преимуществ по сравнению с химически полученными, в частности, они гомогенны по составу, имеют 1:1 стехиометрию и воспроизводимы. Кроме того, рекомбинантные конъюгаты сохраняют 100 % как ферментативную, так и иммунологическую активность.
Достижения последних лет в гетерологической экспрессиии ПХ в клетках E.coli и реактивации рекомбинантной пероксидазы хрена дают возможность получения рекомбинантных конъюгатов с пероксидазой в качестве фермента-маркера и применения их в иммуноферментном анализе. Целью данного этапа работы было получение рекомбинантного конъюгата пероксидазы хрена с белком-переносчиком жирных кислот из серца человека (БПЖК) (human heart-type fatty acid binding protein, FABP). БПЖК - является новым высокоспецифичным маркером инфаркта миокарда. Получение рекомбинантного конъюгата ПХ с БПЖК позволит создать новые экспресс-системы для диагностики инфаркта миокарда.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Похожие диссертационные работы по специальности «Биотехнология», 03.00.23 шифр ВАК
Конформационные различия нативной и рекомбинантных форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами 2002 год, кандидат химических наук Чубарь, Татьяна Анатольевна
Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta 2009 год, кандидат биологических наук Закирова, Светлана Анатольевна
Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств 2009 год, кандидат биологических наук Рябченко, Александр Владимирович
Повышение противоопухолевой активности цитокина TRAIL путем изменения аминокислотного состава белка 2010 год, кандидат биологических наук Яголович, Анна Валерьевна
Использование бета-спирального домена и пептидил-пролил изомеразы для получения фибриллярного адгезина бактериофага Т4 2012 год, кандидат биологических наук Чупров-Неточин, Роман Николаевич
Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Григоренко, Виталий Георгиевич
1. При экспрессии рекомбинантной пероксидазы хрена в переплазму клеток E.coli штамм BL21(DE3) с экспрессионным вектором pETpelHRPhis образуется растворимый, функционально активный фермент с общим выходом около 0,5 мг белка с 1 литра культуры клеток.
2. Цитоплазматическая система экспрессии рекомбинантной ПХ в клетках E.coli штамм BL21(DE3)pLysS с экспрессионным вектором pETHRPhis обеспечивает высокий уровень экспрессии ПХ в форме тел включения (целевой продукт составляет около 30% суммарного клеточного белка клетки). Введение гексагистидиновой последовательности (6xHis) в С- концевую область ПХ позволило эффективно осуществить метал-хелатную хроматографию для выделения и очистки рекомбинантного препарата фермента.
3. На основе данных о влиянии различных реагентов (мочевина, имидазол, глутатион,.) на свойства ПХ, была разработана новая схема рефолдинга и реактивации рекомбинантной ПХ из тел включения, позволяющая получить активный холо-фермент, с выходом 8-10 мг с 1 литра культуры E.coli.
4. Показано, что введение гексагистидиновых последовательностей в N- и С-концевые области фермента, а также замена посредством сайт направленного мутагенеза аминокислотных остатков двух внутренних поверхностных участков (57-61) и (211-216) на гистидиновые соответственно, с разной степенью влияет на каталитические свойства рекомбинантной ПХ.
5. Золотые электроды, модифицированные рекомбинантными формами ПХ, проявляют высокий и стабильный амперометрический сигнал биоэлектрокаталитического восстановления Н2О2 вследствие эффективного прямого переноса электронов между поверхностью золота и активным центром фермента, что служит основой для создания универсального сенсора на Н2О2, а также для создания биферментных сенсоров, основанных на со-иммобилизации ПХ и соответствующих Н2О2- образующих оксидаз (лизин-оксидаза, глюкоз-оксидаза,.).
6. Рекомбинантный конъюгат пероксидазы хрена с белком-переносчиком жирных кислот из сердца человека (БПЖК) обладает как каталитическими свойствами ПХ, так и иммуногенными свойствами БПЖК, что позволяет использовать его в иммуноферментном анализе. Выход целевого продукта составил 12 мг с 1 литра культуры E.coli.
Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Григоренко, Виталий Георгиевич, 2001 год
1. Welinder, K.G. (1992) Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases. Curr. Opin. Struct. Biol., 2:388-393.
2. Dunford, H.B. and Stillman, J.S. (1976) On the function and mechanism of action of peroxidases, Coordination Chemistry Reviews, 19, 187-251
3. English, A.M., Tsaprailis, G. (1995) Catalytic structure-function relationships in heme peroxidases. Adv.Inorg. Chem., 43:79-125
4. Welinder, K.G. Covalent structure of the glycoprotein horseradish peroxidase (EC1.11.1.7). FEBSLett., 1976. 72: p. 19-25.
5. Dunford, H.B. Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties, in Peroxidase in chemistry and Biology, J. Everse, K.E. Everse, and M.B. Grisham, Editors. 1992, CRC Press: Boca Raton, Florida, p. 1-24.
6. Kim, B.B. Pisarev, Y.Y. Egorov, A.M. A comparative study of peroxidases from Horseradish and Arthromyces Ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assay. Anal.Biochem., 1991. 199: p. 1-6.
7. Chiswell, D.J. and Ortlepp S.A. (1989) DNA sequence coding for HRP enzyme. European patent No EP0299682
8. Ortlepp, S.A., Pollard-Knight, D. and Chiswell, D.J. (1989) Expression and characterization of a protein specified by a synthetic horseradish peroxidase gene in Escherichia coli. J. Biotech., 11, 353-364.
9. Newmyer, S.L., Sun, J., Loehr, T.M., De Montellano P.R.O. Rescue of the horseradish peroxidase His-170->Ala mutant activity by imidazole: Importance of proximal ligand tethering. Biochemistry, 1996.35(39): p. 12788-12795.
10. Newmyer, S.L., De Montellano, P.R.O. Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidazoles. Journal of Biological Chemistry, 1996. 271(25): p. 14891-14896.
11. Tanaka, M., Ishimori, K., Morishima, I. The distal glutamic acid as an acid-base catalyst in the distal site of horseradish peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996. 227(2): p. 393-399.
12. Howes, B.D., Rodriguezlopez, J.N., Smith, А.Т., Smulevich, G. Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: Influence on substrate binding and cavity properties. Biochemistry, 1997.36(6): p. 1532-1543.
13. Holzbaur, I.E., English, A.M., Ismail, A.A. Infrared spectra of carbonyl horseradish peroxidase and its substrate complexes: Characterization of pH-dependent conformers. Journal of the American Chemical Society, 1996. 118(14): p. 3354-3359.
14. Gilfoyle, D.J., Rodriguezlopez, J.N., Smith, A.T. Probing the aromatic-donor-binding site of horseradish peroxidase using site-directed mutagenesis and the suicide substrate phenylhydrazine. European Journal of Biochemistry, 1996. 236(2): p. 714-722.
15. Gazaryan, I.G., Galkin, A.G., Doseeva, V.V., Tishkov, V.I. Production and catalytic properties of Phe41->His and Phel43->Glu single-point mutants of horseradish peroxidase expressed in E-coli. Biochemistry Moscow, 1995. 60(10): p. 1187-1192.
16. Nagano, S., Tanaka, M., Watanabe, Y., Morishima, I. Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1995.207(1): p. 417-423.
17. Nagano, S., Tanaka, M., Ishimori, K., Watanabe, Y., Morishima, I. Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. Biochemistry, 1996. 35(45): p. 14251-14258.
18. Ozaki S., De Montellano, P.R.O. Molecular engineering of horseradish peroxidase: Thioether sulfoxidation and styrene epoxidation by Phe-41 leucine and threonine mutants. Journal of the American Chemical Society, 1995. 117(27): p. 7056-7064.
19. Tarns J.W., Welinder, K.G. Deglycosylation of Horseradish Peroxidase, in Biochemical, Molecular, and Physiological Aspects of Plant Peroxidases, J. Lobarzewski, et al., Editors. 1991, Printed by Imprimerie Nationale: Geneve, p. 111-114.
20. Egorov, A.M., Kim, B.B., Pisarev, Y.Y., Kapeliuch, Yu.L., Gazaryan I.G. Fundamental and applied aspects of reaction of enhanced chemiluminescence. in Bioluminescence and Chemiluminescence: Status Report. 1993. Chichester: John Wiley & Sons.
21. Banci, L. Structural properties of peroxidases. J. Biotechnol., 1997, 53,253-263.
22. Patterson, W.R., Poulos, T.L. (1995) Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. Biochemistry, 34: 4331-4341
23. Schuller, D.J., Ban N, Van Huystee, R.B., McPherson, A., Poulos, T.L. (1996) Crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 4:311-321.
24. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T. and Poulos, T.L. (1997) Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nature Structural Biology, 4, 12, 1032-1038.
25. Henriksen, A., Welinder, K.G., Gajhede, M. (1998) Structure of barley grainperoxidase refined at 1.9 A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. J. Biol. Chem., 273, 2241-2248.
26. Savenkova, M.I., Newmyer, S.L., Ortiz de Montellano, P.R. Rescue of His42-Ala horseradish peroxidase by a Phe41-His mutation. Engineering of surrogate catalytic histidine. J.Biol.Chem. 1996, 271, 24598-24603.
27. Tanaka, M., Ishimori, K., Mukai, M., Kitagawa, Т., Morishima, I. Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42-Glu or Gin mutant. Biochemistry, 1997, 36, 9889-9898.
28. Tanaka, M., Nagano, S., Ishimori, K., Morishima, I., (1997) Hydrogen bond network in distal site of peroxidases: Spectroscopic properties of Asn70-Asp horseradish peroxidase mutant. Biochemistry, 36, 9791-9798.
29. Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T., Thorneley, R.N.F., (1996) Role of Arg38 in horseradish peroxidase. A critical residue for substrate binding and catalysis. J. Biol. Chem., 271, 4023-4030.
30. Folkes, L.K., Candeas, L.P. (1997) Interpretation of the reactivity of peroxidase compounds I nad II with phenols by Marcus equation. FEBS Lett., 412, 305-308.
31. Nie, G.J., Aust, S.D. (1997) Spectral changes of lignin peroxidase during reversible inactivation. Biochemistry, 36, 5113-5119.
32. Smulevich, G. et.al. (1994) Characterization of recombinant horseradish peroxidase С and three site directed mutants, F41V, F41W and R38K by resonance Raman spectroscopy. Biochemistry, 33, 7398-7400.
33. Veitch, N.C. & Williams, R.J.P. (1990) Two dimensional "H-NMR studies of horseradish peroxidase С and its interaction with indole-3-propionic acid. Eur. J. Biochem., 189, 351-362.
34. Ruzgas Т., Gorton L., Emneus J., Marco-Varga G. (1995) Kinetic models of horseradish peroxidase action on a graphite electrode, J. Electroanal. Chem., 391,41-49.
35. Lindgren A., Tanaka M., Ruzgas Т., Gorton L., Gazaryan I., Ishimori K., Morishima I. (1999) Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase: insight into the mechanism. Electrochem. Commun., 1, 171-175.
36. Presnova, G., Grigorenko, V., Egorov, A., Ruzgas Т., Lindgren A., Gorton L., Borchers, Т., (2000), Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidases on gold. Faraday Discuss., 116, 281-289
37. Ferapontova, E.E., Grigorenko, V.G., Egorov, A.M., Borchers, Т., Ruzgas Т., Gorton L., (2001) Direct Electron Transfer in the SystemGold Electrode -Recombinant Horseradish Peroxidases. J.Electroan. Chem.
38. Lindbladh, C.; Mosbach, K.; Bulow, L. (1993), Use of genetically prepared enzyme conjugates in enzyme immunoassay.Trends Biochem. Sci., 8, 279-283.
39. Porstman. Т.; Kiessig, S. T. J. (1992) Enzyme immunoassay techniques. An overview.
40. J. Immunol. Methods, 150, 5-21.
41. Wittkowski, A.; Daunert, S.; Kindy, M. S.; Bachas, L. G. (1993), Enzyme-linked immunosorbent assay for an octapeptide based on a genetically engineered fusion protein. Anal. Chem., 65, 1147-1151.
42. Schreiber, A.; Specht, В.; Pelsers, M. M. A. L.; Glatz, J.F.C.; Borchers, Т.; Spener, F. (1998) Recombinant human heart-type fatty acid-binding protein as standard in immunochemical assays. Clin. Chem. Lab. Med., 36,283-288.
43. Grigorenko VG, Chubar ТА, Kapeliuch YuL, Borchers T, Spener, F. and Egorov, A.M., (1999) New approaches for functional expression of recombinant horseradish peroxidase С in Escherichia Coli., Biocatalysis and Biotransformation, 17, 359-379.
44. Grigorenko, V., Andreeva, I., Borchers, Т., Spener, F. and Egorov A.M. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. (2001) Anal.Chem., 73, 11341139.
45. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorf, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods in Enzymology, 185, 60-89.
46. George, P. (1953) The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome с peroxidase and horseradish peroxidase. Biochemical Journal, 54, 267-271.
47. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254
48. Fuhrhop, J.-H. and Smith, K.M. (1975) Laboratory Methods. In Porphyrins and Metalloproteins (ed. K.M. Smith). Elsevier, Amsterdam, pp 757-869.
49. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
50. Hartmann, C., Ortiz de Montellano, P.R. (1992) Baculovirus expression and characterization of catalytically active horseradish peroxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 297, 61 -72.
51. Morawski В., Lin Z„ Cirino P., Joo H„ Bandara G, Arnold F.H. (2000) Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichiapastoris. Protein. Eng., 13(5), 377-84.
52. Freedman, R.B. (1995) The formation of protein disulphide bonds. Current Opinion in Structural Biology, 5, 85-91.
53. Skerra, A. and Pliickthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041.
54. Le, H. V. and Trotta, P .P. (1991) Purification of secreted recombinant proteins from Escherichia coli. Bioprocess Technology, 12,163-181.
55. Gillet, D., Ducancel, F., Pradel, E., Leonetti, M., Menez, A. and Boulain, J.C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E. coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Engineering, 5, 273-278.
56. Ouzzine, M., Boyd, A. and Hulmes, D.J. (1996) Expression of active, human lysyl oxidase in Escherichia coli. FEBS Letters, 399, 215-219.
57. Berezin, I.V., Ugarova, N.N., Kershchengolts, B.M., Brovko, L.I.U. (1975) Effect of prosthetic group of horseradish peroxidase on enzyme stability (in Russian) Biokhimiia 40, 297-301
58. Hargrove, M.S., Krzywda, S., Wilkinson, A.J., Dou, Y., Ikeda-Saito, M. and Olson, J.S. (1994) Stability of myoglobin: a model for the folding of heme proteins. Biochemistry, 33, 11769-11775.
59. Tams J.W. and Welinder K.G. (1995) Mild chemical deglycosylation of horseradish peroxidase yields a fully active, homogeneous enzyme. Analytical Biochemistry, 228, 48-55
60. Smith, A.T. Santana, N., Dacey, S., Edwards, M., Bray, R.C., Thorneley, R.N.F. and Burke, J.F. (1990) Expression of a synthetic gene for horseradish peroxidase
61. С in Escherichia coli and folding and activation of the recombinant enzyme with2+
62. Ca and heme. Journal of Biological Chemistry, 265, 1335-13343.
63. Howes, B.D., Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T. and Smulevich, G. (1997) Mutation of distal residues of horseradish peroxidase: influence on substrate binding and cavity properties. Biochemistry, 36, 1532-1543.
64. Dalton, D.A., Diaz del Castillo, L., Kahn, M.L., Joyner, S.L. and Chatfield, J.M. (1996) Heterologous expression and characterization of soybean cytosolic ascorbate peroxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 328, 1-8.
65. Phelps, С., Antonini, E. (1969) The combination of carbon monoxide-haem with apoperoxidase. Biochemical Journal, 114, 719-724.
66. Rubtsova, M.Y., Kovba, G.V. and Egorov, A.M. (1998) Chemiluminescent biosensors based on porous supports with immobilized peroxidase. Biosensors & Bioelectronics, 13, 75-85.
67. Nakane P.K., Pierce G.B. (1967) Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens. J. Cell Biol., 33, 307-318.
68. Avrameas S., Uriel J. (1966) Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. CR Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545.
69. Miles L.E. (1968) Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature, 219, 186-189.
70. Engvall E., Perlmann P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8, 871-874.
71. Frey A., DiGanzio J, Zurakowski D. (1998) A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Methods, 221, 35-41.
72. Farr A.J., Nakane P.K. (1981) Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review. J. Immunol. Method, 47, 129-144.
73. Ishikawa E., Imagawa M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T. (1983) Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining. J. Immunoassay, 4, 209-327.
74. Pundir C.S., Kuchhal N.K., Bhargava A.K. (1998) Determination of urinary oxalate with oxalate oxidase and peroxidase immobilized on to glass beads. Biotechnol. Appl. Biochem., 27, 103-107.
75. Kuhlmann W.D., Pesche P. (1986) Glucose oxidase as label in histological immunoassays with enzyme-amplification in a two-step technique: coimmobilized horseradish peroxidase as secondary system enzyme for chromogen oxidation. Histochemistry, 85, 13-17.
76. Trivedi R.C., Rebar L., Berta E., Stong L. (1978) New enzymatic method for serum uric acid at 500 nm. Clin. Chem., 24, 1908-1911.
77. Ternaux J.P., Chamoin M.C. (1994) Enhanced chemiluminescent assays for acetylcholine. J. Biolumin. Chemilumin., 9, 65-72.
78. Guo J.A., Mo P.S., Li G.X. (1990) Immobilization of glucose oxidase and peroxidase and their application in flow-injection analysis for glucose in serum. Appl. Biochem. Biotechnol., 23, 15-24.
79. Elekes O., Moscone D., Venema K., Korf J. (1995) Bi-enzyme reactor for electrochemical detection of low concentrations of uric acid and glucose. Clin. Chim. Acta., 239, 153-165.
81. Zhao J., Henkens R.W., Crumbliss A.L. (1996) Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase. Biotechnol. Prog., 12, 703-708.
82. Ruzgas Т., Csoregi E., Emneus J., Gorton L., Marko-Varga G. (1996) Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and application. Anal. Chim. Acta, 330, 123-138.
83. Ferri Т., Poscia A., Santucci R. (1998) Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide.,
84. Bioelectrochem. Bioenerg., 45, 221-226.
85. Wang B, Li B, Wang Z, Xu G, Wang Q, Dong S (1999) Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium. Anal. Chem., 71, 1935-1939.
86. Adam W, Lazarus M, Saha-Moller CR, Weichold O, Hoch U, Haring D, Schreier P (1999) Biotransformations with peroxidases. In: Adv Biochem Engineering Biotechnology, Th Scheper, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 63,73-108.
87. Doerge DR, Divi RL, Churchwell MI (1997) Identification of the colored guaiacol oxidation product produced by peroxidases. Anal. Biochem., 250, 1017.
88. Colonna S., Gaggero N., Richelmi C., Pasta P. (1999) Recent biotechnological developments in the use of peroxidases. Trends Biotechnol., 17, 163-168.
89. Thomas J.A., Morris D.R., Hager .LP. (1970) Chloroperoxidase. Formation of peroxide and halide complexes and their relation to the mechanism of the halogenation reaction. J. Biol. Chem., 245, 3129-3142.
90. Dawson J,H, (1988) Probing structure-function relations in heme-containing oxygenases and peroxidases. Science, 240,433-439.
91. Ortiz De Montellano P.R. (1992) Catalytic sites of hemoprotein peroxidases. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32, 89-107.
92. Ricard J., Job D. (1974) Reaction mechanisms of indole-3-acetate degradation by peroxidases. A stopped-flow and low-temperature spectroscopic study. Eur. J. Biochem., 44, 359-374.
93. Smith A.M., Morrison W.L., Millham P.J. (1982) Oxidation of indole-3-acetic acid by peroxidase: involvement of reduced peroxidase and compound III with superoxide as a product. Biochemistry, 21,4414-4419.
94. Nakajima R., Yamazaki I. (1979) The mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by horseradish peroxidases. J. Biol. Chem., 254, 872-878.
95. Mottley C, Mason RP (1986) An electron spin resonance study of free radical intermediates in the oxidation of indole acetic acid by horseradish peroxidase. J. Biol. Chem., 261, 16860-16864.
96. Dordick J.S., Klibanov A.M., Martella M.A. (1986) Horseradish peroxidase catalyzed hydroxylations: mechanistic studies. Biochemistry, 25, 2946-2951.
97. Kauffmann C., Petersen B.R., Bjerrum M.J. (1999) Enzymatic removal of phenols from aqueous solutions by Coprinus cinereus peroxidase and hydrogen peroxide. J. Biotechnol., 73, 71-74.
98. Al-Kassim L., Taylor K.E. (1994) Enzymatic removal of selected aromatic contaminants from wastewater by a fungal peroxidase from Coprinus macrorhizus in batch reactors. J. Chem. Tech. Biotechnol., 61, 179-182.
99. Sakharov I.Yu., Castillo J.A., Areza J.C., Galaev I.Yu. (2000) Purification and stability of peroxidase of African oil palm Elaies guineensis. Bioseparation, 9, 125-132.
100. Ferrari R.P., Laurenti E., Trotta F. (1999) Oxidative 4-dechlorination of 2,4,6-trichlorophenol catalyzed by horseradish peroxidase. J. Biol. Inorg. Chem., 4, 232-237.
101. Kim S.J., Shoda M. (1999) Purification and characterization of a novel peroxidase from Geotrichum candidum dec 1 involved in decolorization of dyes. Appl. Environ. Microbiol., 65,1029-1035.
102. Peterhans, A.; Mecklenburg, M.; Meussdoerffer, F.; Mosbach, K. (1987) A simple competitive enzyme-linked immunosorbent assay using antigen-beta-galactosidase fusions. Anal. Biochem., 163, 470-475.
103. Ann. N. Y. Acad. Sci., 646, 125-135.
104. Lindbladh, C.; Persson, M.; Bulow, L.; Stahl, S.; Mosbach, K. (1987) The design of a simple competitive ELIS A using human proinsulin-alkaline phosphatase conjugates prepared by gene fusion. Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 607-614.
105. Gillet, D.; Ezan, E.; Ducancel, F., Gaillard, C.; Ardouin, Т.; Istin, M.; Menez, A.; Boulain, J.-C.; Grogent, J.-M. (1993) Enzyme immunoassay using a rat prolactin-alkaline phosphatase recombinant tracer. Anal. Chem., 65, 1779-1784.
106. Lewis, J. C.; Daunert, S. (1999) Dual detection of peptides in a fluorescence binding assay by employing genetically fused GFP and BFP mutants. Anal. Chem., 71,4321-4327.
107. Lindbladh, С.; Mosbach, К.; Bulow, L. (1991) Preparation of a genetically fused protein A/luciferase conjugate for use in bioluminescent immunoassays. J. Immunol. Methods, 137, 199-207.
108. Gillet, D.; Ducancel, F.; Pradel, E.; Leonetti, M.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1992) Insertion of a disulfide-containing neurotoxin into E. coli alkaline phosphatase: the hybrid retains both biological activities. Protein Eng., 5, 273278.
109. Chanussot, C.; Bellanger, L.; Ligny-Lemaire, C.; Seguin, P.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1996) Engineering of a recombinant colorimetric fusion protein for immunodiagnosis of insulin. J. Immunol. Methods, 197, 39-49.
110. Kerschbaumer, R. J.; Hirschl, S.; Schwager, C.; Ibl, M.; Himmler, G. (1996) pDAP2: a vector for construction of alkaline phosphatase fusion-proteins. Immunotechnology, 2, 145-150.
111. Karlsson, R.; Michaelsson, A.; Mattsson, L. (1991) Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J. Immunol. Methods, 145, 229-240.
112. A.M. Egorov, E.M. Gavrilova and I.Yu. Sakharov (2000) Applications of peroxidases in modern biotechnology, In Integrated Plant Systems, H. Greppin et al., eds. University of Geneva, pp. 1-18
113. Krueger, J.K., Stock, A.M., Schutt, C.E., Stock, J.B. 1990. Inclusion bodies from proteins produced at high levels in E.coli, pp. 136-142. L.M. Gierasch and J. King (eds.), Protein folding, American Association for Advances in Science, Washington.
114. Marston, F.A.O. 1986. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in E.coli. Biochem. J. 240: 1-12.
115. Mitraki, A., King, J. 1989. Protein folding intermediates and inclusion body formation. Bio/Technol. 7: 690-697.
116. Schein, C.H. 1989. Production of soluble recombinant proteinsin bacteria. Bio/Technol. 7: 1141-1147.
117. Taylor, G., Hoare, M., Gray, D.R., Marston, F.A.O. 1986. Size and density of protein inclusion bodies. Bio/Technol. 4: 553-557.
118. Anfmsen, C.B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181:223-230.
119. Achareya, A.S., Taniuchi, H. 1982. Implication of the structure and stability of disulfide intermediates of lysozyme on the mechanism of renaturation. Mol. Cell. Biochem. 44: 129-148.
120. Greighton, Т.Е. 1986. Disulfide bonds as probes of protein folding pathways, pp. 83-106. In: C.W.H. Hirs (ed.), Methods in Enzymology, vol. 131. Academic Press, New York.
121. Greighton, Т.Е. 1990. Protein folding. Biochem. J. 270: 1-16.
122. Freedman, R.B., Hillson, D.A. 1980. Formation of disulfide bonds, pp. 157-212. In: R.B. Freedman and H.C. Hawkins (eds.), The enzymology of post-translational modification of proteins, vol. 1. Academic Press, London.
123. Gierasch, L.M., King, J. 1990. Protein folding. American Association for Advances in Science, Washington.
124. Harrison, S.C., Durbin, R. 1985. Is there is a single pathway for the folding of a polypeptide chain? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4028-4030.
125. Jaenicke, R. 1988. Is there a code for protein folding?, pp. 16-36. In: R. Huber and E.L. Winnaker (eds.), Protein structure and protein engineering, vol. 39. Springer-Verlag, Berlin.
126. Jaenicke, R. 1991. Protein folding: local structure, domains and assemblies, pp. 387-396. In: I. Jornvall and G. Gustavsson (eds.), Methods ion protein sequence analysis. Birkhauser Verlag, Basel.
127. Jaenicke, R. 1991. Protein folding: local structure, domains, subunits and assemblies. Biochemistry 30: 3147-3161.
128. King, J. 1986. Genetic analysis of protein folding pathways. Bio/Technol. 4: 297-303.
130. Kim, P.S., Baldwin, R.L. 1982. Specific intermediates in the folding reaction of small proteins and the mechanism of protein folding. Ann. Rev. Biochem. 51: 459-489.144145146147148149150,151.152.153.154.155.156.157.
131. Ahmed, A.K., Schaffer, S.W., Wetlaufer, D.B. 1975. Nonenzymatic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers. J. Biol. Chem. 250: 8477-8482.
132. Saxena, V.P., Wetlaufer, D.B. 1970. Formation of three-dimensional structure in proteins. Biochemistry 9: 5015-5022.
133. Odorzynski, T.W., Light, A. 1979. Refolding of the mixed disulfide of bovine trypsinogen and glutathione. J. Biol. Chem. 254: 4291-4295. Anderson, W.L., Wetlaufer, D.B. 1976. The foldingpathwayof reduced lysozyme. J. Biol. Chem. 251: 3147-3153.
134. Grigorenko V, Andreeva I, Borchers T, Spener F, Egorov A. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. Anal Chem. 2001 Mar 15; 73(6), 1134-9.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.
"Зарубленная" диссертация
Тему искать не пришлось. Все его детство было связано с хреном. Таблеток у деревенских бабушек не было. Здоровье поправляли дарами природы. И как только стаивал снег, шли в огород копать целебный корень. Написал и сам же свою диссертацию "зарубил".
Я подумал, что сметану слизал, не раскрыв сути. За агротехникой упустил что-то главное, - объясняет ученый свой неординарный поступок.
В погоне за истиной он рассуждал примерно так. На родине хрена, в России, в течение 60 лет его практически списали со счетов. Из 500 существовавших сортов осталось всего 2-3. А в Европе, где он появился 200 лет назад, сегодня 2,5 тысячи сортов. В Америке, куда его завезли в 1900 году по инициативе министерства сельского хозяйства, уже 3,5 тысячи. И работа над его разведением продолжается. Зачем?
Первая полузакрытая информация о том, что с помощью препарата из хрена можно излечивать рак, просочилась из Израиля. Позднее "засветились" Америка и Европа. Я обратился к ученым из ящурного института и института микробиологии. Они расшифровали формулу препарата - пероксидаза. Из тонны протертого хрена его получали всего полграмма. Стал приставать, как бы его "пощупать" и посмотреть, - рассказывает Емелин.
Впору было подключать к делу разведчиков. Так и случилось. С их помощью вышли на одну французскую фирму, которая торговала нашей нефтью. Нажали. Те пообещали поставить завод по выпуску пероксидазы. Но технология ее получения оставалась под замком.
Прямо с поля, чтобы не успело улетучиться самое ценное, совхозный хрен отправили на анализ в лабораторию во Францию. Анализ затерялся. Отправили во второй раз.
И оказалось, что в нашем хрене содержание пероксидазы в 50 раз выше, чем в импортном. То есть из одной тонны мы можем получить не 0,5 грамма, а 25 граммов. "Вы хоть 30 тысяч сортов хрена выведете, а такого, как у нас в России, никогда не получите. Это наше достояние", - торжествовал тогда Емелин.
Оказалось, что в нашем хрене содержание пероксидазы в 50 раз выше, чем в импортном.
А защита его диссертации о хрене все-таки состоялась. Научным руководителем была ученица Ивана Владимировича Мичурина профессор сельхозинститута в Балашихе Марина Владимировна Алексеева. Оппонентами - корифеи овощеводства, с трудом верившие, что какой-то колхозник из владимирской глубинки замахнулся на такую тему. Итогом защиты стало методическое пособие по промышленному выращиванию хрена. Тем временем ученые двух владимирских институтов, ящурного и вирусологии, которым Емелин поставлял сырье из своего хозяйства, создали технологию получения отечественной пероксидазы.
Мы стояли на пороге промышленного получения вещества, цена которого на мировом рынке доходила до 7 тысяч долларов за грамм. Если 100 лет назад суздальцы очень выгодно торговали с Германией, отправляя туда по 40 вагонов корней хрена в год, то эта технология могла стать для страны золотым дном, - убежден Юрий Анатольевич.
Но началась перестройка, и стране было не до хрена. Научные исследования свернули, а масштабы его промышленного выращивания сократились до одного поля в совхозе "Ставровский", директором которого к тому времени стал Емелин.
Огородный Змей Горыныч
А может, и хорошо, что ограничились одним полем? - думаю я вслух, вспоминая, как трудно с ним бороться. Стоит завестись хрену в огороде, ни за что не выведешь. На ум приходит рассказ известного артиста, а теперь и губернатора Михаила Евдокимова о том, как пытался избавиться от хрена, но не помог даже тол.
Что же тогда делать?
А не надо с ним бороться. Его можно только приручить. Хрен прекрасно уживается с луком, картошкой и другими огородными культурами и защищает их от вредителей. Это давно подметили наши предки. Еще 500 лет назад они говорили: огород без хрена, как стадо без пастуха. А когда заводили огороды, в первую очередь определяли место, где будет расти хрен.
Не случайно на суздальской земле были хрено-луковые плантации. Сначала убирали лук, а следом за ним хрен. То же и с картофелем. В сентябре его выкопали, а в октябре подошел хрен. Мы сеяли по хрену пшеницу, рожь. И получали по 50-60 центнеров с гектара, - рассказывает Емелин.
Изучая хрен, Емелин дошел до "археологических" раскопок. На участке, где тот рос, просеивал землю и подсчитывал корешки. И сделал вывод, что существует хрен двух видов. Уходящий корнями на глубину до 15 метров он назвал материнским. Образовавшийся в верхнем слое почвы из маленьких корешков, оставшихся после уборки, - верховым.
Истинный хрен - материнский. Он достает с подпочвенных слоев, так называемой адамовой земли, те питательные вещества и элементы, которых здесь уже нет. Но и верховой хрен-сорняк может стать материнским. Дай время, ведь за год он уходит в землю на 60-70 см.
Значит, "заражение" хреном вполне вероятно? - высказываю опасение Емелину. А он в ответ предъявляет новый аргумент:
Хрен - культура саморегулируемая. Как в одну пустую бочку не нальешь две бочки воды, так и на одном участке земли не вырастет его больше, чем положено.
А сколько положено?
Его урожайность - максимум 4-5 тонн корней с гектара. Такое резкое ограничение рамками урожайности отличает хрен от других культур. Это я говорю с полной ответственностью как человек, посвятивший его изучению более 30 лет. Но уж если он поселился, то на века. На земле, где выращивают хрен, он родится по 100 и даже по 300 лет.
Значит, прав Михаил Евдокимов и спасет от него только ядерная бомба? - продолжаю спор от лица всех огородников.
Вы же не будете после того, как собрали яблоки, пилить яблоню? Она даст урожай и на следующий год. Так и с хреном. Раньше его копали в том месяце, в названии которого есть буква "р": сентябрь, октябрь, ноябрь (в остальное время в нем нет той остроты и горчичного запаха)... Срежете, на сколько можете, верхушку, а к следующему сезону на этом месте нарастет еще больше.
Когда на Руси говорили о Змее Горыныче, у которого на месте одной срезанной головы отрастают три, то наверняка имели в виду хрен, - поясняет Емелин.
Зри в корень
СПК "Ставровский" - одно из редких мест в России, где можно увидеть поле цветущего хрена. И говорят, пчелы над ним летают сутками. Правда, хренового меда директору есть не приходилось. А вот цветы дарил. Они, считает Емелин, красоты необыкновенной.
И семена у хрена образуются. Но если их посеять, ничего не взойдет. Хрен размножается только с помощью корней - вегетативно. Почему? Ответа Емелин не нашел. Но зато это один из моментов, позволяющий ученому думать о его древнейшем происхождении. Пережив сильнейшие катаклизмы, растение, видимо, таким образом приспособилось и выжило.
До сих пор нет точного ответа: овощ он, лекарственное растение или пряность? Отсутствие четких видовых границ тоже, по мнению Емелина, подтверждение гипотезы, что хрен - посланец Атлантиды.
Происхождение многих культур давно известно. Откуда же появился хрен, в науке большая путаница. Во многих источниках я читал, что при Тутанхамоне египтяне где-то брали корень на вес золота у варваров. Но твердого убеждения, что это именно хрен, у меня нет, - не скрывает Емелин.
Но, обожествляя предмет своих исследований, он остается практиком. Объехав в поисках селекционного материала около 250 огородов Владимирской и Ярославской областей, вывел новый сорт хрена - "Толпуховский" (по названию центральной усадьбы своего хозяйства) и посадил его плантацию на крутом берегу реки Колокши. Говорит: до следующей цивилизации.
Сам Емелин употребляет хрен как лекарство. Но в отличие от нас, необразованных, учитывает, что полезные свойства в протертом хрене сохраняются только 7 дней.
В хрене, который месяцами "болтается" на магазинных прилавках, да и в наших кладовках, нет ни хрена! - говорит ученый.
Что же делать?
Выкопали из земли осенью килограммов 5-6, положили в погреб, присыпали землей, и пусть себе лежит. Доставайте оттуда понемногу, чтобы хватило на 250-граммовую баночку. Его два раза в году можно брать: зимой и ранней весной. Зимой - из погреба. А весной, чуть земля оттаяла, можно смело выкапывать до тех пор, пока листочки не отрастут до 5 сантиметров. Так делали наши предки, которые на Пасху ели поросенка со свежим хреном.
Емелину можно верить. Недавно он одну за другой выпустил три книги: "Хрен в вашем огороде", "Хрен ваш доктор" и "Хрен на вашем столе". Теперь готовит к изданию "Хренолечебник". И продолжает опровергать стереотип, что хреново - это значит плохо.
А может, действительно, когда у нас говорят, что жизнь совсем хреновая, имеют в виду только судьбу русского хрена?
Способ предусматривает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия. Отделяют балластные белки и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония 45-48% насыщения и 85-90% насыщения соответственно. Гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия. Хроматографическую очистку проводят на карбоксиметилцеллюлозе. Осуществляют лиофильную сушку целевой пероксидазы. Проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1. Осуществляют концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды. Способ позволяет получить пероксидазу с высокой удельной активностью и высоким выходом. Выход пероксидазы составляет 2,52-3,50 г/кг корней хрена, удельная активность - 640-700 Е.А./мг белка. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Рисунки к патенту РФ 2353652
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству ферментов из растительного сырья, и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства фермента пероксидазы из корней хрена для иммунологии и иммунохимии в качестве главной составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов.
Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена .
Известен способ получения пероксидазы из корней хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента солевым раствором, осаждение фермента солями сульфата аммония, гельфильтрацию, спиртовое осаждение, электрофорез, переосаждение хлоридом аммония, фильтрацию через сефадекс G-50 и ДЭАЭ-целлюлозу и диализ .
Основными недостатками данного способа являются невысокая активность и чистота полученного продукта, а также сложность его получения и большое количество стадий технологического процесса.
Известен также способ получения пероксидазы из корней хрена, по которому корни хрена гомогенизируют, затем экстрагируют фермент водой и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония с последующей гельфильтрацией [Пат. Венгрии 172872, C07G 7/022].
Недостатком данного способа является низкий выход и низкая чистота фермента.
Известен способ [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90], по которому корни хрена проращивают в течение 2-3 суток, затем гомогенизируют и экстрагируют фермент водой в течение суток. Водный экстракт центрифугируют с последующим фракционированием белков солями сульфата аммония, затем сульфатаммонийный осадок фермента растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации на фильтрах "Милипор" PTGC 000 05. К полученному фильтрату прибавляют 0,5 М фосфатный буфер (рН 8) в соотношении 100 частей буфера на 1 часть фильтрата и пропускают через колонку с ионообменником ДЭАЭ-Сефадекс А-50, затем последовательно ультрафильтруют на "Милипор" PTGC 000 05, РТНК 000 05, PTGC 000 05 и подвергают лиофильной сушке.
Недостатком данного метода является недостаточно высокий выход пероксидазы, высокая трудоемкость и длительность процесса.
Наиболее близким является способ [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999], в котором промытые водой корни хрена зачищают на 1/3 массы в присутствии 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, используемого в качестве экстрагирующего раствора. Пероксидазу из очисток экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором аскорбиновой кислоты, затем экстракт фильтруют и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют 5% сульфита натрия и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре для "созревания" фермента. "Созревший" раствор фермента концентрируют на ультрафильтрационных волоконных аппаратах с фильтрами, имеющими диаметр пор менее 40 кДа. К сконцентрированному в 10 раз раствору добавляют сульфат аммония до конечного насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в десятикратном объеме бидистиллированной воды и наносят на колонку, заполненную сефадексом G-25, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу с величиной R Z >0,1. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу, с величиной R Z >0,5. Фракции смешивают, дотитровывают до рН 4,4 и подвергают очистке на карбоксиметилцеллюлозе, фермент элюируют в градиенте концентраций от 5 мМ до 0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4) (V=S-500 мл, R-500 мл). Собирают фракции с величиной R Z >2,7 и с концентрацией фермента не менее 10 мг/мл. Фракции объединяют, дотитровывают до рН 5,0 и лиофильно высушивают.
Недостатками данного метода являются недостаточно высокая чистота и активность и небольшие выходы пероксидазы.
Изобретение решает задачу создания промышленного способа получения пероксидазы из корней хрена, позволяющего получать пероксидазу с высокой чистотой, с высокой удельной активностью и с высоким выходом.
Поставленная задача решается способом получения фермента пероксидазы из корней хрена, который включает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, при этом измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1 и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.
Дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение,
Хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.
Лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.
На Фиг.1 приведена принципиальная схема выделения пероксидазы из корней хрена.
Корни хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщенные корни измельчают и экстрагируют 0,15 М раствором хлорида натрия в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.
К супернатанту-1 (Фиг.1) при непрерывном перемешивании добавляют 16,7±0,05 кг (45-48% насыщения) сульфата аммония, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а к образовавшемуся супернатанту-2 (Фиг.1) добавляют еще 11,8±0,05 кг (85% насыщения) сульфата аммония, осадок (Фиг.1) отделяют центрифугированием и растворяют дистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл. После центрифугирования супернатант, содержащий пероксидазу, наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100, и элюируют 0,15 М раствором хлорида натрия со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют и диализуют против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (буфер-1), затем обессоленный раствор пероксидазы наслаивают на колонку, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1, и элюируют линейным градиентом 5 мМ - 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют и диализуют против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2), отдиализованный раствор фермента наслаивают на колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, и элюируют буфером-2. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют и диализуют против деионизованной воды, затем переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.
Существенными отличительными признаками предлагаемого способа получения биологически активных веществ являются:
Использование гельфильтрации на сефадексе G-100 для максимально полной очистки пероксидазы от низкомолекулярных примесей;
Диализ против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0), позволяющий обессолить раствор пероксидазы и подготовить его к хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе;
Диализ против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1), позволяющий перевести раствор пероксидазы в оптимальный буфер с оптимальным рН для нанесения на ДЭАЭ-целлюлозу;
Ионообменная хроматография пероксидазы на ДЭАЭ-целлюлозе как прием, обеспечивающий не только дополнительную очистку, но и концентрирование раствора фермента.
Таким образом, нами предлагается новый подход, позволяющий осуществлять переработку корней хрена с получением фермента пероксидазы высокой чистоты и удельной активности.
Отличие заявляемого способа от ближайшего аналога и прототипа состоит в следующем.
В заявляемом способе измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2, тем самым достигается максимально полный переход фермента в раствор, и при этом фермент не теряет своей активности.
В аналоге изобретения [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999] пероксидазу из очисток (без гомогенизации!) экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором пищевой аскорбиновой кислоты, что может сказываться на выходе пероксидазы, поскольку очистки не гомогенизируются, а следовательно, фермент переходит в раствор далеко не полностью, при этом экстракция протекает в кислых условиях, что может привести к частичной инактивации фермента. В прототипе изобретения [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90] фермент из гомогенизата корней хрена экстрагируют водой, что также приводит к низкому выходу пероксидазы из гомогенизата в раствор.
В отличие от аналога изобретения, где пероксидазу осаждают дважды 85-90% насыщением сульфатом аммония, и прототипа изобретения, где четыре раза проводят осаждение белков солями сульфата аммония, в заявляемом способе проводят отделение балластных белков 45-48% насыщением, а затем осаждают пероксидазу 85% насыщением.
В аналоге и прототипе изобретения концентрирование проводят методом ультрафильтрации, при этом в аналоге изобретения ультрафильтрация предшествует сульфатаммонийному осаждению пероксидазы, что приводит к большой вероятности соосаждения примесных белков, а соответственно, к более низкой чистоте конечного продукта. В заявляемом способе пероксидаза подвергается концентрированию на ионообменном сорбенте ДЭАЭ-целлюлоза на заключительной стадии технологического процесса, что приводит и к дополнительной очистке фермента.
В заявляемом способе гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0), что позволяет полностью избавиться от зеленоватого оттенка раствора пероксидазы, обусловленного наличием хлорофилла и родственных соединений, и веществ с меньшим, чем у пероксидазы, размером молекул. В аналоге изобретения гельфильтрацию проводят на сефадексе G-25, который по способности задерживать примесные частицы, учитывая размер молекулы пероксидазы (около 40 кДа), уступает сефадексу G-100.
Сущность изобретения иллюстрируется следующим примерами.
Пример 1. Получение грубого экстракта
50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщеные корни измельчают на лопастном гомогенизаторе и заливают 50 л 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4±0,2). Суспензию экстрагируют в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.
К супернатанту-1 объемом 60 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. (Под 100%-ным насыщением имеется в виду количество соли, при добавлении которого раствор становится насыщенным, а при дальнейшем добавлении соли раствор становится пересыщенным, и соль выпадает в осадок. Для растворов с сульфатом аммония 100% насыщением является добавление и полное растворение 70,7 г сульфата аммония в 100 мл дистиллированной воды.) Осадок-1 отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант-2 объемом 55 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок-2 отделяют центрифугированием. Образовавшийся осадок-2 растворяют деионизованной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок-3 отделяют центрифугированием.
Гель-хроматография на сефадексе G-100.
Раствор пероксидазы наносят на колонку объемом 1 л, заполненную сефадексом G-100. Элюцию ведут 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0) со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют.
В сборник помещают 5 л 5±0,1 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0) (буфер-1) и диализный мешок с объединенными фракциями пероксидазы. Диализ ведут при постоянном перемешивании в течение 24 ч, трижды меняя буфер в сборнике.
Обессоленный раствор фермента наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1. Элюцию ведут со скоростью 50 мл/ч в линейном градиенте 5 мМ-0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют.
В сборник помещают 5 л 20±0,1 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2) и диализный мешок с объединенными фракциями фермента. Диализ ведут аналогично.
Концентрирующая хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.
Раствор фермента с рН 8,0±0,1 наслаивают на колонку объемом 300 мл, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию ведут буфером-2 со скоростью 50 мл/ч. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют.
В сборник помещают 5 л деионизованной воды и диализный мешок с раствором пероксидазы. Диализ ведут аналогично.
Лиофильная сушка.
Раствор пероксидазы переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.
Пример 2 (сравнительный)
В данном примере выдержаны условия получения пероксидазы по прототипу, но для улучшения основных показателей пероксидазы изменены две существующие в прототипе стадии, а именно: для ультрафильтрационного концентрирования раствора пероксидазы используют два типа колонок с полыми волокнами, в отличие от прототипа, где используют один тип волокон, и дробное фракционирование белков солями сульфата аммония (как в заявляемом способе).
Получение грубого экстракта.
50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и зачищают на 1/3 часть массы в присутствии 33,5 л 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, в котором полученные очистки выдерживают в течение 1 ч для экстракции фермента пероксидазы. Далее экстракт центрифугируют на проточной центрифуге и выдерживают в течение 24 ч для "созревания" фермента.
Первичная очистка и концентрирование.
В полученный экстракт добавляют 1,7 кг (5% по весу) сульфита натрия и экстракт подвергают концентрированию и первичной очистке методом ультрафильтрации на установке с полыми полимерными волокнами УПВ-6, укомплектованной колонками с фильтрами, имеющими размеры пор 60 кДа и 5 кДа. Принципиальная схема установки представлена на Фиг.2, где показаны центробежный насос 1; предфильтр 2; колонка с волокнами, имеющими размер пор 60 кДа 3; колонка с волокнами, имеющими размер пор 5 кДа 4; фильтрат пероксидазы 5; концентрированный раствор пероксидазы 6; фильтрат, содержащий низкомолекулярные белки 7.
Фракционирование белков солями сульфата аммония.
К концентрату объемом 6 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант объемом 5,7 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок отделяют центрифугированием, который растворяют бидистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием.
Гель-хроматография на сефадексе G-25 и G-50.
Дальнейшую очистку пероксидазы проводят на колонке для гельфильтрации, заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной бидистиллированной водой. Раствор пероксидазы наносят на колонку, элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,2. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до 90% насыщения, перемешивают до полного растворения соли и центрифугируют. Осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50 и уравновешенную бидистиллированной водой. Элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,6. С помощью 50% уксусной кислоты значение рН во фракциях с пероксидазой устанавливают на уровне 4,4.
Хроматография на карбоксиметилцеллюлозе.
Фракции пероксидазы наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой, предварительно уравновешенную 5 мМ ацетатным буфером с рН 4,4. Элюирование проводят линейным градиентом 5 мМ-0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л) в течение 1 часа. В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,7, объединяют, устанавливают рН 5,0 добавлением аммиака и лиофильно высушивают.
Сравнительные данные по примеру 1 и 2 приведены в таблице.
| Таблица Сравнительные данные основных параметров качества пероксидазы из корней хрена при использовании двух способов получения. |
||
| Наименование технологического параметра, единицы измерения. | Пример 1 (заявляемый способ) | Пример 2 (известный способ) |
| Выход по массе пероксидазы, г/кг корней хрена. | 2,52-3,50 | 0,21-0,85 |
| Удельная активность препарата, Е.А./мг белка* | 640-700 | 560-610 |
| Чистота по спектрофотометру R Z =D 408 /D 275 | 3,00-3,20 | 2,70-3,00 |
| * - Удельная активность вычислялась с использованием данных, приведенных в работе СТП 103.34-83. Правила вычисления и обработки результатов количественного анализа. НИКТИ БАВ, 1983. |
Таким образом, как видно из примеров и таблицы, заявляемый способ получения пероксидазы из корней хрена (пример 1) позволяет получать пероксидазу с высокими выходами, с чистотой и активностью, достаточной для использования данного фермента в качестве составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов. А в условиях прототипа (пример 2) даже при усовершенствовании двух стадий, улучшающих показатели, выход, удельная активность и чистота целевой пероксидазы ниже аналогичных показателей заявляемого способа.
Данный способ может быть использован в промышленном получении пероксидазы из корней хрена.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена, включающий размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1, и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН 4,4±0,2.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения пероксидазы хрена включает гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония. Осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере. Затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе МОРS-NаОН буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях pH и pK буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют. Способ обеспечивает упрощение получения высокоочищенной пероксидазы хрена и повышение ее выхода. 2 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к получению высокоочищенной пероксидазы хрена адсорбционной хроматографией.
Высокоочищенная пероксидаза хрена (критерий очистки А 403 /А 275 3,1 - RZ от Reinheitszahl - показатель чистоты) - один из наиболее востребованных ферментов для биохимии и биотехнологии. В частности, она широко используется в методах иммуноферментного анализа, например, для определения ВИЧ-инфекции, гепатитов и других социально значимых заболеваний человека.
Известен способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через сефадекс G-50, ионообменной хроматографией и диализом .
Недостатками этого способа являются сложность и продолжительность получения, сравнительно низкая чистота полученного препарата (RZ~2,7), трудность получения большого количества фермента.
Известен также способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацию .
Недостаток этого способа заключается в низком выходе фермента, низкой его чистоте.
Задачей данного изобретения является повышение выхода высокоочищенного фермента при упрощении способа производства.
Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка белков против 0,01-0,03 М раствора TEA (триэтаноламин)-HCl буфера, последовательную очистку пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS(N-морфолинопропансульфоновая кислота)-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта, и концентрации, обеспечивающей движение пероксидазы вниз по колонке, по принципу адсорбции-десорбции, со скоростью, меньшей, чем у части балластных белков, имеющих одноименный заряд с зарядом на колонке, тогда как другая их часть остается на старте вследствие ионного обмена; раствор очищенного целевого продукта диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl с последующей лиофилизацией, причем фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой, сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% от насыщения, а значения pH и pK буферов составляют 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно.
Отличием данного способа является одновременное использование одного и того же носителя для адсорбционной хроматографии целевого продукта и для очистки от балластных белков, при значениях pH, близких к изоточке целевого продукта, а также использование буферов небольшой концентрации со значениями pK, близкими к изоточке фермента, причем компоненты буферов имеют объемистые электронодонорные или электроноакцепторные группы, конкурирующие за адсорбент с группами макромолекулы пероксидазы. Пероксидазу хрена получают из сока корней хрена, собранных в самом начале цветения, в это время содержание фермента в корнях в 3-4 раза выше, по сравнению с прототипом.
Техническим результатом решения задачи является получение пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента (субстрат 4-аминоантипирин) за одну стадию. Выход фермента 3,2 г из 100 кг корней, что в 6 раз выше по сравнению с прототипом. Предложенный способ позволяет уменьшить число стадий и за счет этого снизить время на получение целевого продукта и увеличить в 1,5-2 раза его выход.
Известно, что адсорбция белков на каком-либо сорбенте связана с различными нековалентными взаимодействиями макромолекулярных групп с поверхностью этого сорбента. Однако их суммарная энергия мала по сравнению, например, со связыванием белок-ингибитор при аффинной хроматографии или ионными взаимодействиями на ионообменнике. Таким образом, адсорбционное взаимодействие маскируется другими, более сильными взаимодействиями поверхность белка-поверхность носителя. Поэтому, если предполагается очистить данный белок адсорбционной хроматографией, необходимо создать такие условия, чтобы балластные белки либо связывались на колонке, либо двигались по ней быстрее целевого белка, т.е. чтобы только данный белок мог медленно двигаться по принципу адсорбции-десорбции. Такие условия создаются, если использовать в качестве носителя для адсорбционной хроматографии целлюлозу, а для очистки от балластных белков использовать ДЭАЭ- и КМ-группы. Для того чтобы добиться одновременного движения целевого фермента по принципу адсорбционной хроматографии, а части балластных белков - вследствие отталкивания заряженного белка от одноименно заряженных групп, необходимо совместить эти группы и целлюлозный носитель, т.е. использовать ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Если проводить хроматографию при значениях pH, близких к изоточке целевого фермента, часть балластных белков задерживается на старте вследствие ионного обмена, а часть быстро движется вниз из-за взаимодействия с одноименными зарядами ионообменника. Незаряженный или слабо заряженный фермент будет медленно двигаться, по сравнению с балластными белками, вниз и на ДЭАЭ- и на КМ-целлюлозах в случае конкуренции между группами фермента и компонентами буфера за сорбент.
Буфер имеет:
1) небольшую концентрацию, поскольку при ее повышении конкуренция компонентов буфера может быть столь сильной, что целевой продукт будет двигаться со скоростью, сравнимой со скоростью движения балластных белков, и очистки не произойдет;
2) поскольку буфер должен обеспечить устойчивое значение pH при небольшой концентрации, он должен иметь pK, близкое к изоточке целевого продукта;
3) компоненты буфера должны иметь объемистые группы для эффективной конкуренции с поверхностными группами целевого продукта. Балластные белки будут заряжены при этом значении pH и, в зависимости от заряда, либо остаются на старте («ионный обмен»), либо движутся значительно быстрее целевого продукта (взаимодействие одноименных зарядов). Незаряженный или слабо заряженный целевой продукт будет отделяться и от белков, остающихся на старте, и от быстро движущихся белков. Лишь белки, имеющие изоточки, близкие к изоточке пероксидазы, могли бы связываться адсорбционно и тем самым уменьшать степень очистки, но, как показывает опыт, такие белки в соке из корней хрена отсутствуют или находятся в минорном количестве.
Очистка целевого продукта:
1) белки из сока корней хрена после их гомогенизации экстрагируют водой, доводят ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают сульфатом аммония, диализуют против воды, а затем против 0,01-0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1-7,4 и наносят последовательно на колонки с ДЭАЭ-целлюлозой в Cl - -форме и КМ-целлюлозой в Na + -форме, уравновешенные соответственно 0,01-0,03 М ТЕА-HCl и 0,01-0,03 М MOPS-NaOH буферами, pH 7,1-7,4 (pK буферов 7,5 и 7,6; изоточка пероксидазы 7,2);
2) за медленным движением коричневого кольца фермента следят визуально;
3) после выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01-0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01-0,03 М NaCl и лиофилизируют;
4) измеряют значения RZ продукта и его активность по 4-аминоантипирину.
Для измерения пероксидазной активности в кювету вносят 1,5 мл фенол-аминоантипиринового раствора (810 мг фенола растворяют в 40 мл воды, добавляют 25 мг 4-аминоантипирина и разбавляют водой до 50 мл), 1,4 мл раствора пероксида водорода (1 мл 30% H 2 O 2 разбавляют водой до 100 мл; далее 1 мл этого раствора разбавляют 0,2 М калий-фосфатным буфером, pH 7,0 до 50 мл), 0,1 мл раствора фермента. Измерение оптической плотности проводят при 510 нм и температуре 25°С. Определяют скорость из линейной части кривой:
ед/мг=( А 510 /мин)/6,58×мг фермента/мл.
Концентрация фермента равна: мг фермента/мл=А 403 ×0,44.
Следующие примеры иллюстрируют эти положения.
Пример 1. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (70% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,01 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией (определение белка по Бредфорд или Лоури) и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.
Пример 2. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (75% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,4. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,4, pK 7,6. Далее хроматографируют целевой продукт, как в примере 1, на КМ-целлюлозе, но в 0,03 М MOPS-NaOH буфере, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.
Выход: 3,2 г пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.
Пример 3. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,01 М TEA-HCl буфере, pH 7,1 центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1, pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.
Пример 4. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,03 М TEA-HCl буфере, pH 7,4, центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.
Выход составляет 1,5 г целевого продукта с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.
Таким образом, предлагаемый способ в сравнении с прототипом позволяет получить целевой продукт с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину. Выход фермента составляет 3,2 г на на 100 кг корней, что превышает выход по прототипу ~ в 6 раз. Кроме того, полученный целевой продукт обладает большей чистотой по сравнению с прототипом (RZ соответственно 3,35 и 2,7). Упрощение способа выражается в сокращении биохимических стадий с четырех до одной. Этот способ позволяет также выделять высокоочищенную пероксидазу из лиофильно высушенного низкоочищенного фермента.
Источники литературы
1. Paul К.G. The Enzymes. New York, Acad. Press, 1963.
2. Патент РФ № 2130070.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка, отличающийся тем, что осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно, очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% насыщения.