Аналіз рослин, біогеоценологія (методичка). Методи вивчення рослинних організмів. Значення ботанічних знань для підготовки фахівців з агрохімії та ґрунтознавства Хімічні методики дослідження у рослинах
Ще на початку XVI ст. була встановлена важлива істина: лікувальні властивостікожної рослини визначаються її хімічним складом, тобто наявністю в ньому тих чи інших речовин, що надають певний вплив на організм людини. В результаті аналізу численних фактів вдалося виявити певні фармакологічні властивості та спектр терапевтичної дії багатьох груп хімічних сполук, які називаються діючими речовинами. Найважливіші з них - алкалоїди, глікозиди серцевої дії, тритерпенові глікозиди (сапоніни), флавоноїди (та інші фенольні сполуки), кумарини, хінони, ксангони, сесквітерпенові лактони, лігнани, амінокислоти, полісахариди та деякі З 70 груп відомих зараз природних сполук нас часто цікавить лише кілька груп, що мають біологічну активність. Це обмежує можливості вибору і цим прискорює пошуки потрібних нам природних хімічних речовин. Наприклад, противірусною активністюмають лише деякі групи флавоноїдів, ксантонів, алкалоїдів, терпеноїдів та спиртів; протипухлинний- деякі алкалоїди, ціаніди, тритерпенові кетони, дитерпеноїди, полісахариди, фенольні сполуки та ін. Поліфенольним сполукам властива гіпотензивна, спазмолітична, противиразкова, жовчогінна та бактерицидна активність. Багато класів хімічних сполук та індивідуальні хімічні речовини мають строго певний і досить обмежений спектр медико-біологічної активності. Інші ж, зазвичай, дуже великі класи, наприклад алкалоїдимають дуже широкий, різноманітний спектр дії. Такі сполуки заслуговують на різнобічне медико-біологічне вивчення і насамперед у цікавих для нас напрямках, що рекомендуються . Успіхи аналітичної хіміїдозволили розробити нескладні та швидкі методи (експрес-методи) виявлення у потрібних нам класів (груп) хімічних сполук та окремих хімічних речовин. У результаті виник і широко впровадився у практику пошукових робіт метод масових хімічних аналізів, інакше званий хімічним скринінгом (від англійського слова screening – просіювання, сортування через решето). Нерідко він практикується для пошуку необхідних хімічних сполук шляхом аналізу всіх рослин досліджуваного району.
Метод хімічного скринінгу
Метод хімічного скринінгу у поєднанні з даними про використання рослини в емпіричній медицині та з урахуванням її систематичного становища дає найбільш ефективні результати. Досвід свідчить, що майже всі рослини, що використовуються в емпіричній медицині, містять відомі нам класи біологічно активних сполук. Тому пошук потрібних нам речовин перш за все, слід цілеспрямовано вести серед рослин, які виявили свою фармакологічну або хіміотерапевтичну активність. Експрес-методможе поєднуватися з попереднім відбором перспективних видів, різновидів і популяцій в результаті їх органолептичної оцінки та аналізу етноботанічних даних, що побічно свідчать про наявність у рослині речовин, що цікавлять нас. Подібний метод відбору широко використовував академік М. І. Вавілов при оцінці якості вихідного матеріалу. корисних рослин, що залучаються для селекційно-генетичних досліджень Протягом років перших п'ятирічок таким шляхом проводилися пошуки у флорі СРСР нових каучуконосних рослин.
Вперше у широких масштабах метод хімічного скринінгупри пошуках нових лікарських рослинпочав застосовувати начальник середньоазіатських експедицій Всесоюзного науково-дослідного хіміко-фармацевтичного інституту (ВНІХФД) П. С. Масагетов. Обстеження понад 1400 видів рослин дозволило академіку А. П. Орєхову та його учням до 19G0 р. описати близько 100 нових алкалоїдів та організувати в СРСР виробництво тих з них, які необхідні для медичних цілей та боротьби з сільськогосподарськими шкідниками. Інститут хімії рослинних речовин АН Узбецької РСР обстежив близько 4000 видів рослин, виявив 415 алкалоїдів, вперше встановив будову 206 з них. Експедиціями ВІЛР обстежено 1498 видів рослин Кавказу, 1026 видів Далекого Сходу, багато рослин Середньої Азії, Сибіру, європейської частини СРСР. Тільки Далекому Сході виявлено 417 алкалоїдо-носних рослин, у тому числі секуринега полукустарниковая, що містить новий алкалоїд секуринін - засіб стрихниноподобного дії. До кінця 1967 р. у всьому світі було описано та встановлено структуру 4349 алкалоїдів. Наступний етап пошуку - поглиблена різнобічна оцінка фармакологічної, хіміотерапевтичної та протипухлинної активностівиділених індивідуальних речовин або їх сумарних препаратів. Слід зазначити, що в цілому по країні та у світовому масштабі хімічні дослідженнязначно випереджають можливості глибокої медико-біологічної апробації нових хімічних сполук, які у рослинах. В даний час встановлено структуру 12 000 індивідуальних сполук, виділених з рослин, на жаль, багато з них ще не піддавалися медико-біологічному вивченню. З усіх класів, хімічних сполук найбільше значення, Безумовно, мають алкалоїди; 100 з них рекомендовані як важливі медичні засоби, наприклад, атропін, берберин, кодеїн, кокаїн, кофеїн, морфін, папаверин, пілокарпін, платифілін, резерпін, сальсолін, секуренін, стрихнін, хінін, цитизин, ефедрин та ін. внаслідок пошуків, в основі яких лежав хімічний скринінг. Однак насторожує односторонній розвиток цього методу, в багатьох інститутах і лабораторіях зведеного до пошуків лише алкалоїдоносних рослин, Не можна забувати про те, що, крім алкалоїдів, щорічно виявляються нові біологічно активні рослинні речовини, що належать до інших класів хімічних сполук. Якщо до 1956 р. була відома структура лише 2669 природних сполук із рослин, які не належать до алкалоїдів, то в наступні 5 років (1957-1961 рр.) у рослинах було знайдено ще 1754 індивідуальні органічні речовини. Нині кількість хімічних речовин із встановленою структурою сягає 7000, що разом із алкалоїдами становить понад 12 000 рослинних речовин. Хімічний скринінгповільно виходить із «алкалоїдного періоду». З 70 груп і класів рослинних речовин, відомих в даний час (Karrer et al., 1977), він проводиться лише в 10 класах сполук, бо відсутні надійні і швидкі експрес-методи встановлення наявності в рослинній сировині інших сполук. Залучення до хімічного скринінгу нових класів біологічно активних сполук - важливий резерв підвищення темпів та ефективності пошуку нових ліків з рослин. Дуже важливою є розробка методів швидкого пошуку окремих хімічних речовин, наприклад, берберину, рутину, аскорбінової кислоти, морфіну, цитизину та ін. Найбільший інтерес при створенні нових лікувальних препаратів становлять вторинні сполуки, або так звані речовини специфічного біосинтезу. Багато з них мають широкий спектр біологічної активності. Наприклад, алкалоїди дозволені для застосування в медичній практиці як аналептики, болезаспокійливі, седативні, гіпотензивні, відхаркувальні, жовчогінні, спазмолітичні, маткові, тонізуючі центральну. нервову системута адреналіноподібних препаратів. Флавоноїди здатні зміцнювати стінки капілярів, знижувати тонус гладкої мускулатури кишечника, стимулювати секрецію жовчі, підвищувати знешкоджуючу функцію печінки, деяким з них властиво спазмолітичну, кардіотонічну та протипухлинну дію. Багато поліфенольних сполук використовують як гіпотензивні, спазмолітичні, противиразкові, жовчогінні та антибактеріальні засоби. Протипухлинна активність відзначена у ціанідів (наприклад, що містяться в насінні персика та ін), тритерпенових кетонів, дитерпеноїдів, полісахаридів, алкалоїдів, фенольних та інших сполук. Дедалі більше препаратів виробляють із серцевих глікозидів, амінокислот, спиртів, кумаринів. полісахаридів, альдегідів, сесквітерпенових лактонів, стероїдних сполук. Нерідко медичне застосуваннязнаходять вже давно відомі хімічні речовини, у яких лише недавно вдалося виявити ту чи іншу медико-біологічну активність та розробити раціональний метод виготовлення препаратів. Хімічний скринінг дозволяє як намітити нові перспективні вивчення об'єкти, а й: - виявити кореляції між систематичним становищем рослини, її хімічним складом та медико-біологічною активністю;
- з'ясувати географічні та екологічні фактори, що сприяють чи перешкоджають накопиченню в рослинах тих чи інших діючих речовин;
- визначити значення біологічно активних речовин для рослин, що їх виробляють;
- виявити у рослин хімічні раси, що спадково відрізняються один від одного наявністю тих чи інших діючих речовин.
Дослідження органів рослин
Різні органи рослини нерідко відрізняються як кількісним вмістом діючих речовин, а й їх якісним складом. Наприклад, алкалоїд синоменін міститься лише в траві луносемянника даурського, а цитизин - лише в плодах термопсису ланцетовидного, відсутні в його наземних частинах до закінчення цвітіння рослин, у той час як у термопсису черговоквіткового цитизин у великій кількості міститься в надземних частинах . Саме тому для отримання повної картини хімічного складу кожної рослини потрібно зробити аналіз не менше чотирьох її органів: підземних (коріння, кореневища, цибулини, бульби), листя та стебел (у трав листя завжди багатше діючими речовинами, ніж стебла), квіток (або суцвіть ), плодів та насіння. У деревно-чагарникових рослин діючі речовини часто накопичуються в корі стебел (і коренів), інколи ж лише у сходах, деяких частинах квітки, плоду і насіння.
Хімічний склад кожного органу рослини значно коливається також у різні фази його розвитку. Максимум вмісту одних речовин спостерігається в фазу бутонізації, інших - у фазу повного цвітіння, третіх - під час плодоношеннята ін. Наприклад, алкалоїд тріакантин міститься у значних кількостях тільки в листі, що розпускається, гледичії триколючкової, у той час як в інші фази розвитку у всіх органах цієї рослини він практично відсутній. Таким чином, неважко підрахувати, що для виявлення, наприклад, тільки повного спискуалкалоїдоносних рослин флори СРСР, що налічує близько 20 000 видів, потрібно зробити не менше 160 000 аналізів (20 000 видів X 4 органу X 2 фази розвитку), що вимагатиме близько 8000 днів роботи 1 лаборанта-аналітика. Приблизно стільки часу потрібно витратити, щоб визначити наявність чи відсутність у всіх рослинах флори СРСР флавоноїдів, кумаринів, серцевих глікозидів, танідів, полісахаридів, тритерпенових глікозидів і кожного іншого класу хімічних сполук, якщо проводити аналізи без попереднього вибракування рослин з тих чи інших міркувань. Крім того, однакові органи в тій же фазі розвитку рослини в одному районі можуть мати потрібні речовини, що діють, а в іншому районі - не мати їх. Крім географічних та екологічних факторів (вплив температури, вологості, інсоляції та ін), тут може позначитися наявність у даної рослини особливих хімічних рас, зовсім не помітних за морфологічними ознаками. Все це дуже ускладнює завдання і, здавалося б, робить перспективи закінчення попередньої хімічної оцінки флори СРСР, а тим більше земної кулі дуже віддаленими. Однак знання певних закономірностей дозволяє значно спростити цю роботу. По-перше, зовсім не обов'язково досліджувати всі органи у всі фази розвитку. Достатньо аналізувати кожен орган в оптимальну фазу, коли він містить найбільша кількістьдосліджуваної речовини. Наприклад, попередніми дослідженнями встановлено, що листя і стебла найбільш багаті на алкалоїди у фазу бутонізації, кора - в період весняного руху соку, а квітки - у фазу їх повного розпускання. Плоди і насіння, щоправда, можуть містити різні алкалоїди і в різній кількості в зрілому і незрілому стані, і тому, по можливості, їх треба досліджувати двічі. Знання цих закономірностей значно спрощує роботи з попередньої хімічної оцінки рослин. Суцільне обстеження всіх видів- спосіб дієвий, але все ж таки це робота наосліп! Чи можна, не проводячи навіть найпростішого хімічного аналізу, відрізнити групи рослин, які, ймовірно, містять той чи інший клас хімічних сполук, від свідомо не містять цих речовин? Іншими словами, чи можна визначити хімічний склад рослин? Як буде сказано в наступному розділі нашої брошури, загалом це питання ми можемо відповісти позитивно. ФЕДЕРАЛЬНЕ АГЕНТСТВО З ОСВІТИ
ВОРОНІЖСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІНФОРМАЦІЙНО-АНАЛІТИЧНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ ПРИРОДООХОРОНОЇ ДІЯЛЬНОСТІ У СІЛЬСЬКОМУ ГОСПОДАРСТВІ
Навчально-методичний посібник для вузів
Укладачі: Л.І. Брехова Л.Д. Стахурлова Д.І. Щеглов А.І. Громовик
Вороніж - 2009
Затверджено Науково-методичною радою біолого-ґрунтового факультету – протокол № 10 від 4 червня 2009 р.
Рецензент д.б.н., професор Л.О. Яблонських
Навчально-методичний посібник підготовлено на кафедрі ґрунтознавства та управління земельними ресурсами біолого-ґрунтового факультету Воронезького державного університету.
Для спеціальності: 020701 - Грунтознавство
Недолік чи надлишок будь-якого хімічного елемента викликає порушення нормального перебігу біохімічних та фізіологічних процесів у рослинах, що зрештою змінює врожайність та якість рослинницької продукції. Тому визначення хімічного складу рослин та показників якості продукції дозволяє ідентифікувати несприятливі екологічні умови зростання як культурної, так і природної рослинності. У зв'язку із цим хімічний аналіз рослинного матеріалу є невід'ємною частиною природоохоронної діяльності.
Практичний посібник з інформаційно-аналітичного забезпечення природоохоронної діяльності сільському господарствіскладено відповідно до програми лабораторних занять з «Біогеоценології», «Аналізу рослин» та «Природоохоронної діяльності у сільському господарстві» для студентів 4-го та 5-го курсів ґрунтового відділення біологопочвенного факультету ВДУ.
МЕТОДИКА ВЗЯМУ РОСЛИННИХ ПРОБ І ПІДГОТОВКА ЇХ ДО АНАЛІЗУ
Взяття проб рослин є дуже відповідальним моментом у результативності діагностики харчування рослин та оцінки доступності їм ґрунтових ресурсів.
Усю площу досліджуваного посіву візуально ділять на кілька ділянок залежно від її розміру та стану рослин. Якщо в посіві виділяються ділянки з явно найгіршими рослинами, то на карті поля відзначаються ці ділянки, з'ясовують, чи не є поганий стан рослин наслідком ентоїлі фітозахворювання, місцевого погіршення властивостей ґрунту чи інших умов зростання. Якщо ці чинники не пояснюють причини поганого стану рослин, можна припустити, що порушено їх харчування. Це перевіряється методами рослинної діагностики. Беруть про-
б з ділянок з найгіршими і найкращими рослинами та ґрунти під ними та за їх аналізами з'ясовують причини погіршення рослин та рівень їх харчування.
Якщо за станом рослин посів не однорідний, при відборі проб слід домагатися, щоб зразки відповідали середньому стану рослин цьому ділянці поля. З кожного виділеного масиву по двох діагоналях беруть рослини з корінням. Вони використовуються: а) для обліку приросту маси та ходу утворення органів – майбутньої структури врожаю та б) для хімічної діагностики.
У ранні фази (при двох – трьох листках) у пробі має бути не менше 100 рослин з 1 га. Пізніше для зернових, льону, гречки, гороху та інших – щонайменше 25 – 30 рослин із 1 га. У великих рослин (дорослих кукурудзи, капусти та ін) беруть нижнє здорове листя не менше, ніж з 50 рослин. Щоб зважити на накопичення по фазах і винесення врожаєм, беруть в аналіз всю надземну частину рослини.
У деревних порід - плодових, ягідників, винограду, декоративних та лісових - у зв'язку з особливостями їх вікових змін, періодичності плодоношення і т. д. взяття проб дещо складніше, ніж у польових культур. Виділяють такі вікові групи: сіянці, дички, щеплені дворічки, саджанці, молоді та плодоносні (почали плодоносити, у повному та загасаючому плодоношенні) дерева. У сіянців у перший місяць їх зростання в пробу входить повністю вся рослина з наступним поділом її на органи: листя, стовбури та коріння. У другій і наступні місяці відбирають листя, що цілком сформувалося, зазвичай – перші два після наймолодших, рахуючи від верхівки. У дворічних дичок також беруть перші два листи, що сформувалися, рахуючи від верхівки ростової втечі. У щеплених дворічок і саджанців беруть, так само як і у дорослих, середнє листя ростових пагонів.
У ягідників – аґрусу, смородини та інших – відбирають з пагонів поточного приросту по 3 – 4 листи з 20 кущів для того, щоб у пробі
було щонайменше 60 – 80 листя. У суниці в тій же кількості відбирають доросле листя.
Загальною вимогою є уніфікація техніки відбору, обробки та зберігання проб: взяття з усіх рослин суворо одних і тих же частин за їх ярусністю, віком, розташуванням на рослині, відсутністю захворювання тощо. Має значення також, чи знаходилося листя на прямому сонячному світлі або в тіні, причому у всіх випадках повинні бути відібрані листя однакового розміщення по відношенню до сонячного освітлення, краще на світлі.
При аналізі кореневої системи середню лабораторну пробу перед зважуванням обережно промивають у водопровідній воді, споліскують у дистильованій воді та підсушують фільтрувальним папером.
Лабораторна проба зерна або насіння береться з безлічі місць (мішка, ящика, машини) щупом, потім її розподіляють рівним шаром на папері у вигляді прямокутника, ділять на чотири частини і беруть матеріал із двох протилежних частин до потрібної кількості для аналізу.
Одним із важливих моментіву підготовці рослинного матеріалу до аналізу є правильна фіксація його, якщо аналізи не передбачається проводити у свіжому матеріалі.
Для хімічної оцінки рослинного матеріалу за загальним вмістом елементів живлення (N, P, K, Ca, Mg, Fe та ін) зразки рослин висушують до повітряно-сухого стану в сушильній шафі
перетурі 50 - 60 ° або на повітрі.
В аналізах, за результатами яких будуть зроблені висновки про стан живих рослин, слід використовувати свіжий матеріал, оскільки зав'ядання викликає суттєву зміну складу речовини або зменшення її кількості і навіть зникнення речовин, що містяться в
живі рослини. Наприклад, целюлоза не торкається руйнуванням, а крохмаль, білки, органічні кислоти та особливо вітаміни піддаються розкладанню після кількох годин зав'ядання. Це змушує експериментатора проводити аналізи у свіжому матеріалі в дуже стислі термінищо не завжди можна зробити. Тому часто використовують фіксацію рослинного матеріалу, мета якої полягає у стабілізації нестійких речовин рослин. Вирішальне значення у своїй має інактивація ферментів. Використовуються різні прийоми фіксації рослин, залежно від завдань досвіду.
Фіксація пором. Цей вид фіксації рослинного матеріалу застосовується тоді, коли немає необхідності визначення воднорозчинних сполук (клітинного соку, вуглеводів, калію та ін.). Під час обробки сирого рослинного матеріалу може відбуватися такий сильний автоліз, що склад кінцевого продукту іноді значно відрізняється від вихідного складу матеріалу.
Практично фіксацію парою проводять наступним чином: усередині водяної лазні підвішується металева сітка, зверху лазня покривається щільним негорючим матеріалом і вода нагрівається до бурхливого виділення пари. Після цього на сітку всередині лазні міститься свіжий рослинний матеріал. Час фіксації 15 – 20 хв. Потім рослини висуши-
ються в термостаті при температурі 60°.
Температурна фіксація.Рослинний матеріал поміщають у пакети із щільного паперу типу «крафт», а соковиті плодиі овочі в подрібненому вигляді пухко укладають в емальовані чи алюмінієві кювети. Матеріал витримують 10 – 20 хв за нормальної температури 90 - 95°. При цьому інактивується більша частинаферментів. Після цього тургор, що втратила, листостебельну масу і плоди висушують в сушильній шафі при температурі 60° з вентиляцією або без неї.
При використанні цього методу фіксації рослин необхідно пам'ятати, що тривале висушування рослинного матеріалу
перетурі 80° і вище призводить до втрат і змін речовин внаслідок хімічних перетворень (термічного розкладання деяких речовин, карамелізації вуглеводів тощо), а також внаслідок леткості амонійних солей та деяких органічних сполук. Крім цього, температура сирого рослинного матеріалу не може досягти температури довкілля(сушильного шафи), поки не випарується вода і поки все тепло, що підводиться, не перестане перетворюватися на приховану теплоту пароутворення.
Швидке та обережне висушування рослинної проби у ряді випадків також вважають прийнятним та допустимим методом фіксації. При вмілому проведенні цього процесу відхилення у складі сухої речовини можуть бути невеликими. При цьому відбувається денатурація білків та інактивація ферментів. Як правило, сушіння проводять у сушильних шафах(термостати) або спеціальних сушильних камерах. Значно швидше та надійніше висушується матеріал, якщо через шафу (камеру) циркулює нагріте повітря. Найбільш підходяща температура для висо-
шивання від 50 до 60 °.
Висушений матеріал краще зберігається у темряві та на холоді. Оскільки багато речовин, що містяться в рослинах, здатні самоокислятися навіть у сухому стані, рекомендується зберігати висушений матеріал у щільно закриваються судинах (склянках з притертою пробкою, ексікаторах та ін.), доверху заповнених матеріалом, щоб у судинах не залишалося багато повітря.
Заморожування матеріалу.Рослинний матеріал дуже добре зберігається за температури від –20 до -30°, за умови, що заморожування відбувається досить швидко (не більше 1 години). Перевага зберігання рослинного матеріалу у замороженому стані обумовлена як дією охолодження, так і зневодненням матеріалу внаслідок переходу води у твердий стан. Треба враховувати, що при заморожуванні
ні ферменти інактивуються лише тимчасово і після відтавання в рослинному матеріалі можуть відбуватися ферментативні перетворення.
Обробка рослин органічними розчинниками. Якість-
ве фіксуючих речовин можна використовувати киплячий спирт, ацетон, ефір та ін. Фіксація рослинного матеріалу цим способом проводиться опусканням його у відповідний розчинник. Однак при цьому методі відбувається не лише фіксація рослинного матеріалу, а й екстракція низки речовин. Тому застосовувати таку фіксацію можна лише тоді, коли заздалегідь відомо, що речовини, які потрібно визначати, не вилучаються цим розчинником.
Висушені після фіксації рослинні проби подрібнюються ножицями, а потім на млині. Подрібнений матеріал просіюється через сито з діаметром отворів 1 мм. При цьому з проби нічого не викидається, тому що видаляючи частину матеріалу, що не пройшов через сито з першого просіювання, ми тим самим змінюємо якість середньої проби. Великі частинки пропускаються через млин та сито повторно. Залишки на ситі слід розтерти у ступці.
З підготовленої таким чином середньої лабораторної проби беруть аналітичну пробу. Для цього рослинний матеріал, розподілений рівним тонким шаром на листі глянцевого паперу, ділять по діагоналях на чотири частини. Потім два протилежні трикутники прибирають, а масу, що залишилася, знову розподіляють тонким шаром на всьому аркуші паперу. Знову проводять діагоналі і знову прибирають два протилежні трикутники. Так роблять доти, доки на листі не залишиться кількість речовини, яка необхідна для аналітичної проби. Відібрана аналітична проба переноситься в скляну банкуіз притертою пробкою. У такому стані може зберігатися невизначено довгий час. Вага аналітичної проби залежить від кількості та методики досліджень і коливається від 50 до кількох сотень грамів рослинного матеріалу.
Усі аналізи рослинного матеріалу повинні проводитись з двома паралельно взятими навішуваннями. Тільки близькі результати можуть підтвердити правильність проведеної роботи.
Працювати з рослинами потрібно в сухій та чистій лабораторії, що не містить парів аміаку, летких кислот та інших сполук, які можуть вплинути на якість проби.
Результати аналізів можуть бути розраховані як на повітряносуху, так і на абсолютно суху навішування речовини. При повітряно-сухому стані кількість води у матеріалі перебуває у рівновазі з парами води у повітрі. Ця вода називається гігроскопічною, і кількість її залежить як від рослини, так і стану повітря: чим вологіше повітря, тим більше гігроскопічної води в рослинному матеріалі. Для перерахунку даних на суху речовину необхідно визначати кількість гігроскопічної вологи у пробі.
ВИЗНАЧЕННЯ СУХОЇ РЕЧОВИНИ І ГІГРОСКОПІЧНОЇ ВОЛОГИ У ПОВІТРЯНО-СУХОМУ МАТЕРІАЛІ
При хімічному аналізі кількісне вміст тієї чи іншої складової частини розраховується на суху речовину. Тому перед аналізом визначають кількість вологи в матеріалі і цим знаходять кількість в ньому абсолютно сухої речовини.
Хід аналізу. Аналітичну пробу речовини розподіляють тонким шаром на аркуші глянцевого паперу. Потім шпателем із різних місцьрозподіленої на аркуші речовини беруть невеликі щіпки його попередньо висушений до постійної ваги скляний бюкс. Наважка повинна становити приблизно 5 г. Бюкс разом з наважкою зважують на аналітичних вагах і поміщають у термостат, температуру якого підтримують на рівні 100-1050 . Перший раз у термостаті відкритий бюкс із наважкою тримають протягом 4-6 годин. Після закінчення цього часу бюкс з термостату переносять в ексікатор для охолодження через 20-30
хвилин бюкс зважують. Після цього бюкс відкривають і знову поміщають термостат (при тій же температурі) на 2 години. Висушування, охолодження і зважування повторюють до тих пір, поки бюкс з наважкою не досягне постійної ваги (різниця між двома останніми зважуваннями повинна бути меншою за 0,0003 г).
Обчислення відсотка води виробляють за такою формулою:
де: х – відсоток води; в - навішування рослинного матеріалу до висушування, г; в1 - навішування рослинного матеріалу після висушування.
Обладнання та посуд:
1) термостат;
2) скляні бюкси.
Форма запису результатів
Вага бюкса з |
Вага бюкса з |
||||||||
наважкою по- |
|||||||||
наважкою до |
Наважка до |
Наважка по- |
|||||||
після висуши- |
|||||||||
висушування- |
висушування- |
слід вису- |
|||||||
шивання, г |
|||||||||
ВИЗНАЧЕННЯ «СИРИЙ» ЗОЛИ МЕТОДОМ СУХОГО ОЗОЛЕННЯ
Золою називають залишок, що отримується після спалювання та прожарювання органічних речовин. При спалюванні вуглець, водень, азот і частково кисень випаровуються і залишаються лише нелеткі оксиди.
Зміст та склад зольних елементів рослин залежить від видової приналежності, росту та розвитку рослин та особливо від ґрунтовокліматичних та агротехнічних умов їх вирощування. Концентрація зольних елементів суттєво відрізняється у різних тканинах та органах рослин. Так, вміст золи в листі та трав'янистих органах рослин значно вищий, ніж у насінні. У листі золи більше, ніж у стеблах,
При визначенні потреби рослин у добривах поряд з агрохімічними аналізамигрунту, польовими та вегетаційними дослідами, мікробіологічними та іншими способами дедалі більше стали застосовуватися методи рослинної діагностики.
В даний час широко використовуються такі методи рослинної діагностики: 1) хімічний аналіз рослин, 2) візуальна діагностика та 3) ін'єкція та обприскування. Хімічний аналіз рослин – найпоширеніший метод діагностики потреби у внесенні добрив.
Хімічна діагностика представлена трьома видами: 1) листовою діагностикою, 2) тканинною діагностикою та 3) швидкими (експрес) методами аналізу рослин.
Важливими етапами роботи з рослинної діагностики за допомогою хімічного аналізу є: взяття проби рослини для аналізу; 2) облік супутніх умов проростання рослин; 3) хімічний аналіз рослин; 4) обробка аналітичних даних та складання висновку про потребу рослин у добривах.
Взяття проби рослин для аналізу. При відборі рослин для аналізу слід добиватися того, щоб узяті рослини відповідали середньому стану рослин даній ділянці поля. Якщо посів однорідний, можна обмежитися однією пробою; якщо ж є плями краще за розвинені або, навпаки, гірше розвинені рослини, то з кожної з таких плям беруть окрему пробу для з'ясування причини зміненого стану рослини. Зміст поживних речовину добре розвинених рослинах може бути використане в цьому випадку як показник нормального складу цього виду рослин.
При проведенні аналізів необхідно уніфікувати техніку взяття та підготовки зразка: взяття однакових частин рослини за ярусністю, становищем на рослині та за фізіологічним віком.
Вибір частини рослини аналізу залежить від методу хімічної діагностики. Для отримання достовірних даних необхідно брати проби не менше ніж із десяти рослин.
У деревних культур у зв'язку з особливостями їх вікових змін взяття проб рослин дещо складніше, ніж у польових культур. Рекомендується проводити дослідження у наступні вікові періоди: сіянці, саджанці, молоді та плодові рослини. Слід брати листя, їх черешки, нирки, пагони або інші органи з верхньої третини пагонів із середньої зони крони дерев або чагарників одного віку та бонітету, дотримуючись одного і того ж порядку, а саме: або тільки з плодових, або тільки з неплодових пагонів, або з пагонів поточного приросту, або листя, що знаходиться на прямому сонячному або розсіяному світлі. Всі ці моменти мають бути враховані, оскільки вони впливають на хімічний склад листя. Зазначається, що найкраща кореляція між хімічним складом листка та врожаєм плодів виходить у тому випадку, якщо як пробу брати лист, у пазусі якого розвивається квіткова нирка.
У яку фазу розвитку рослини слід брати зразки для аналізу? Якщо на увазі отримання найкращої кореляції з урожаєм, то аналіз рослин у фазу цвітіння або дозрівання виявляється найкращим. Так, Люндегорд, Коларжик та інші дослідники вважають, що такою фазою для всіх рослин є цвітіння, тому що до цього моменту основні ростові процеси закінчуються і приріст маси не «розбавлятиме» відсотковий вміст речовин.
Для вирішення завдання, як змінити харчування рослин, щоб забезпечити формування найкращого врожаю, Треба аналізувати рослини в більш ранні періоди розвитку і не один раз, а кілька (три-чотири), починаючи з появи одного-двох листків.
Час взяття проб. I термін: для ярих зернових (пшениці, вівса, кукурудзи) - у фазу трьох листків, тобто до початку диференціації зародкового колосу або волоті; для льону – початок «ялинки»; для картоплі, бобових, бавовнику та інших - фаза чотирьох-п'яти справжніх листків, тобто до бутонізації; для цукрових буряків - фаза трьох справжніх листків.
II термін: для ярих зернових - у фазу п'яти листків, тобто у фазу трубкування; для буряків – у фазу розгортання шостого листка; для решти - при утворенні перших дрібних зелених бутонів, тобто до самого початку бутонізації.
ІІІ термін: у фазу цвітіння; для буряків - при розгортанні восьмого-дев'ятого листка.
IV термін: у фазу молочної стиглості насіння; для буряків – за тиждень до збирання.
У деревних рослин і ягідників проби беруть за наступними фазами формування врожаю: а) до цвітіння, тобто на початку сильного росту; б) цвітіння, тобто в період сильного росту та фізіологічного обсипання зав'язей; ) дозрівання та збирання врожаю та д) період осіннього листопада.
При встановленні терміну взяття проби рослин необхідно також враховувати, який період зростання та розвитку припадають критичні рівні харчування. Під терміном «критичні рівні» розуміють найменші концентрації поживних речовин у рослинах у відповідальний період їх розвитку, тобто концентрації, нижче яких настає погіршення стану рослини та зниження врожаю. Під оптимальним складом рослини розуміють такий вміст у ньому поживних речовин у відповідальні фази його розвитку, у якому забезпечується отримання високого врожаю.
Величини критичних рівнів та оптимального складу наведені для деяких культур нижче. Проби беруть у всіх випадках в один і той же час доби, краще вранці (о 8-9 годині), щоб уникнути змін складу рослин за рахунок добового режиму харчування.
Облік супутніх умов. Судити про достатність чи недостатність харчування рослин тими чи іншими елементами лише за даними хімічного аналізу не завжди правильно. Відомо чимало фактів, коли нестача одного або кількох елементів живлення, затримка фотосинтезу або порушення водного, теплового та інших життєво важливих режимів може викликати накопичення того чи іншого елемента в рослині, що в жодному разі не повинно характеризувати достатність цього елемента в поживному середовищі (ґрунті ). Щоб уникнути можливих помилок і неточностей у висновках, необхідно дані хімічного аналізу рослин порівняти з низкою інших показників: з вагою, зростанням і темпом розвитку рослин у момент взяття проби та з кінцевим урожаєм, з візуальними діагностичними ознаками, з особливостями агротехніки, з агрохімічними властивостями ґрунту , з умовами погоди та рядом інших показників, що впливають на харчування рослин. Тому однією з найважливіших умов успішного використання рослинної діагностики є найбільш докладний облік всіх цих показників для подальшого зіставлення їх між собою та з даними аналізу.
Хімічний аналіз рослин за Останніми рокамиотримав визнання і велике поширення у багатьох країнах світу як метод дослідження харчування рослин у польовій обстановці та як метод визначення потреби рослин у добривах. Перевагою цього є добре виражена залежність між показниками аналізу рослин та ефективністю відповідних добрив. Для аналізу беруть не всю рослину, а якусь певну частину, частіше листок або черешок листка. Цей метод називається листовою діагностикою.
Хімічний аналіз рослин проводиться для визначення кількості елементів харчування, що надійшли в них, за яким можна судити про необхідність застосування добрив (методи Нейбауера, Магницького та ін), визначення показників харчової та кормової гідності продукції (визначення крохмалю, цукру, білка, вітамінів і т.д.). д) і для вирішення різних питань харчування рослин та обміну речовин.
Підживлення рослин міченим азотом у цьому досвіді проводилося через 24 дні після появи сходів. Як підживлення застосовувався сульфат амонію з триразовим збагаченням ізотопом І15 у дозі 0,24 г N на судину. Так як внесений підживлення мічений сульфат амонію розбавлявся в грунті звичайним сульфатом амонію, внесеним перед посівом і не повністю використаним рослинами, фактичне збагачення сульфату амонію в субстраті було трохи нижче, приблизно 2,5. З таблиці 1, в якій поміщені врожайні дані та результати хімічного аналізу рослин, випливає, що при експозиції рослин на міченому азоті від 6 до 72 годин вага рослин практично залишався на тому самому рівні і тільки через 120 годин після внесення азотного підживлення він помітно збільшився.
До цього часу в хімічній таксономії не вдається розділити рослини на великі таксономічні групи на підставі будь-якої хімічної сполуки або групи сполук. Хімічна таксономія виходить із хімічного аналізу рослин. Головна увага досі приділялася європейським рослинам і рослинам помірного пояса, систематичне дослідження тропічних рослин було недостатнім. В останнє десятиліття, однак, набуває все більшого значення головним чином біохімічна систематика, а саме з двох причин. Однією є зручність застосування швидких, простих і добре відтворюваних хіміко-аналітичних методів вивчення складу рослин (до цих методів відносяться, наприклад, хроматографія і електрофорез), другий - простота ідентифікації органічних сполук в рослинах; обидва ці фактори сприяли вирішенню таксономічних проблем.
При обговоренні результатів хімічного аналізу рослин ми вказували, що за цими даними неможливо було встановити будь-які закономірності у зміні вмісту запасних білків у рослинах за різних термінів їх збирання. Результати ізотопного аналізу, навпаки, вказують на сильне оновлення цих азоту (білків через 48 і 96 годин після внесення підживлення з міченим азотом. Це змушує нас визнати, що насправді запасні білки, так само як і конституційні, зазнавали безперервних змін в організмі рослин. І якщо в перші терміни після збирання ізотопний склад азоту запасних білків не змінювався, то це не підстава для того, щоб робити висновок про відому їх стійкість у ці терміни досвіду.
Проведені одночасно хімічні аналізи рослин показали, що загальна кількість білкового азоту як в цьому, так і в іншому аналогічному досвіді за такі короткі проміжки часу практично майже не змінювалася або змінювалася на порівняно незначну величину (у межах 5-10%). Це свідчить про те, що в рослинах, крім утворення нової кількості білка, постійно відбувається оновлення білка, що вже міститься в рослині. Таким чином, молекули білка в організмі рослин мають порівняно невелику тривалість життя. Вони безперервно руйнуються і знову відтворюються в процесі інтенсивного обміну речовин рослин.
Зазначені методи діагностики харчування з хімічного аналізу рослин ґрунтуються на визначенні у листі валового вмісту головних елементів живлення. Відібрані зразки рослин висушують та розмелюють. Потім у лабораторних умовах навішування рослинного матеріалу озолюють з подальшим визначення валового вмісту N, Р205, КгО> CaO, MgO та інших поживних речовин. У паралельній наважці визначають кількість вологи.
У таблиці 10 наведено врожайні дані та дані хімічного аналізу рослин для обох серій досвіду.
Однак у всіх цих дослідах до аналізу надходили середні проби рослин, як це робиться при звичайних визначеннях розмірів засвоєння рослинами фосфору з добрив. Різниця полягала лише в тому, що кількість фосфору, взятого рослинами з добрива, визначалася не по різниці між вмістом фосфору в контрольних і досвідчених рослинах, а шляхом прямого вимірювання кількості міченого фосфору, що надійшов у рослину з добрива. Паралельно проведені хімічні аналізи рослин вміст фосфору у цих дослідах давали можливість визначити, яка частка від загального вмісту фосфору у рослині припадала на фосфор добрива (мічений) і фосфор, узятий з грунту (німецький).
Валовий аналіз проводиться або на листі певного положення на рослині, або у всій надземній частині, або в інших індикаторних органах.
Діагностика з валового аналізулистя - зрілих, які закінчили зростання, але активно функціонуючих, отримала назву «листова діагностика». Вона була запропонована французькими вченими Лагатю та Момом і підтримана Люндегордом. В даний час цей вид хімічної діагностики широко використовується як за кордоном, так і в нашій країні, особливо для рослин, у коренях яких майже повністю відновлюються нітрати і тому за цією формою в надземних частинах неможливо контролювати азотне харчування (яблуня та інші сім'ячкові та кісточкові). , хвойні, багаті на дубильні речовини, цибулинні та ін).
При валових аналізах листя чи інших частин рослин використовуються звичайні методи озоления органічного речовини визначення у ньому N, Р, До, Ca, Mg, S та інших елементів. Найчастіше визначення ведуть у двох навішуваннях: в одній визначають азот за К'єльдалем, в іншій - інші елемени після мокрого, напівсухого або сухого озолення. При мокрому озоленні використовують або міцну H2SO4 з каталізаторами, або в суміші з HNO3, або з HClO4, або з H2O2. При сухому озоленні необхідний ретельний контроль за температурою, так як при спалюванні при температурі понад 500° можуть бути втрати Р, S та інших елементів.
З ініціативи Франції в 1959 р. було організовано Межинститутський комітет з вивчення техніки хімічної листової діагностики у складі 13 французьких, 5 бельгійських, 1 голландського, 2 іспанських, 1 італійського та 1 португальського інститутів. У 25 лабораторіях цих інститутів було проведено хімічні аналізи тих самих проб листя 13 культур (польових і садових) на валовий вміст у яких N, Р, До, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu і Zn. Це дозволило Комітету після математичної обробки даних рекомендувати способи отримання стандартних проб листя і дати стандартні методи їх хімічного аналізу контролю точності таких аналізів при листової діагностиці.
Озолення зразків листя рекомендується проводити наступним чином: для визначення загального азоту по Кьєльдалю озоляти з H2SO4 (уд. вага 1,84), з каталізаторами K2SO4 + CuSO4 та селеном. Для визначення інших елементів використовують сухе озоленіе проби в платиновому посуді при поступовому (за 2 години) нагріванні муфелю до 450 ° С; після охолодження в муфелі за 2 години золу розчиняють у 2-3 мл води + 1 мл HCl (уд. вага 1,19). Випарюють на плитці до появи першої пари. Додають воду, фільтрують у мірну колбу ємністю 100 см3. Осад з фільтром озолюють при 550° (максимум), додають 5 мл плавикової кислоти. Висушують на плитці при температурі не вище 250° С. Після охолодження доливають 1 мл тієї ж HCl і знову фільтрують ту саму колбу, змиваючи теплою водою. Фільтрат, доведений до 100 мл водою, використовують для аналізу вміст макро- і мікроелементів.
Є досить велике варіювання у методах озоления рослинних проб, які різняться головним чином за видами рослин - багаті жирами чи кремнієм тощо. буд., і з завданням визначення тих чи інших елементів. Достатньо докладний опистехніки використання цих методів сухого озолення дано польським вченим Новосільським. Їм же надано описи різних способівмокрого озоления за допомогою тих чи інших окислювачів: H2SO4, HClO4, HNO3 чи H2O2 у тому чи іншому поєднанні залежно від визначених елементів.
Для прискорення аналізу, але не на шкоду точності, вишукуються шляхи такого способу озоління рослинної проби, який дозволив би визначити в одній навішуванні кілька елементів. В. В. Піневич використовував для визначення в одній навішуванні N і Р озоління H2SO4 і в подальшому додавав 30% H2O2 (перевіряючи її на відсутність Р). Цей принцип озоління з деякими уточненнями знайшов широке застосування у багатьох лабораторіях Росії.
Інший широко застосовуваний метод кислотного озоления навішування визначення в ній одночасно кількох елементів було запропоновано К.Е. Гінзбург, Г.М. Щеглової та Є.А. Вульфіус і заснований на використанні суміші H2SO4 (уд. вага 1,84) і HClО4 (60%) щодо 10: 1, причому суміш кислот попередньо готується на всю партію аналізованого матеріалу.
При необхідності визначати сірку в рослинах описані методи озоління не годяться, оскільки включають сірчану кислоту.
PX. Айдінян із співробітниками запропонував спалювання рослинної проби для визначення в ній сірки, змішуючи її з бертолетовою сіллю та чистим піском. Метод В. І. Кузнєцова із співробітниками є дещо переробленим методом Шенігера. Принцип методу полягає в швидкому озоленні проби в колбі, заповненій киснем, з наступним титруванням сульфатів, що утворилися при цьому, розчином хлористого барію з нітхромазо-металіндикатором на барій. Щоб забезпечити більшу точність та відтворюваність результатів аналізу, нами рекомендується пропускання отриманого розчину через колонку з іонообмінною смолою в H+ формі з метою звільнення розчину від катіонів. Отриманий таким чином розчин сульфатів слід упарювати на плитці до об'єму 7-10 мл і охолодження титрувати.
Новосільський, вказуючи на великі втрати сірки при сухому озоленні, наводить рецепти озоління рослин для цих аналізів. Автор вважає одним з найпростіших і найшвидших метод озолення за Буттерсом і Ченері з азотною кислотою.
Визначення вмісту кожного елемента в озоленій тим чи іншим способом пробі проводиться різноманітними методами: колориметричними, комплексонометричними, спектрофотометричними, нейтроно-активаційним, за допомогою автоаналізаторів та ін.